漆酶在褐腐菌接触纤维素机制中作用的研究

芬顿反应产生的羟基自由基是褐腐菌接触和利用纤维素的重要手段，但该反应底物（H2O2和Fe2+ ）来源不清楚。氢醌可还原三价铁离子，但在大量分泌草酸的褐腐菌中该机制无法实现，因为草酸和三价铁离子形成的络合物还原电位比氢醌低。耐酸性漆酶在大量草酸存在情况下可将氢醌转化为电位更低的半氢醌自由基而实现三价铁的还原，但漆酶在褐腐菌中的存在及其作用还有争议。本研究将（1）采用分子生物学方法对褐腐菌(Postia placenta)基因组中的漆酶类似序列进行功能鉴定，并对漆酶基因的表达调控进行研究，以确定漆酶的存在、数目和表达调控机理。（2）构建适用于该菌的农杆菌转化体系，采用同源重组方法对漆酶基因进行依次敲除，通过比较野生型和突变型菌株降解木质素、纤维素能力差异确定漆酶在降解木质纤维素中的作用。（3）通过化学分析的方法确定突变株和野生株生理条下产生羟基自由基的能力，确定其与木质纤维素降解能力之间的关系

褐腐菌是一种能在少降解木质素的情况下通过只有内切酶的纤维素酶系统有效利用纤维素和半纤维素的真菌，它独特的接触和利用纤维素的方式为人类有效利用农业废物中的纤维素和半纤维素提供了一个很好的范例，因此对这种机制的研究具有非常重要的意义。 之前的体外实验表明,漆酶可能在这个途径中起到一定的作用。但确切的结果还需要进一步的体内实验研究才能得到。因为在真菌中经常存在多个漆酶的同源序列, 现在的研究通常只鉴定了其中一个或几个基因，另外一些漆酶同源序列的功能还有待研究。如果丝状真菌中含有两个或者多个漆酶基因,那么它们在木质素降解中所起的作用有何不同?为了在漆酶功能和木质素降解机制之间建立起更为直接的关系,首先需要弄清楚这些同工酶之间催化能力的差异，这样才能够对其作用进行细致研究。其次，很多研究表明，多个漆酶基因的存在可能是微生物适应不同环境所需，因此我们还对这些漆酶基因在不同环境下的表达进行研究。第三，漆酶基因表达的调控机制在研究其功能的过程中也非常重要，对信号通路研究可以为理解其功能提供更多的支持。而最终的功能确定则需要对各个不同漆酶基因进行敲除或者通过RNAi方法抑制其表达才能进行，需要构建该丝状真菌漆酶基因缺失或表达下调菌株。 为此，通过电激菌丝、原生质体法和农杆菌介导等方法构建了转化体系，最终用RNAi方法构建了漆酶表达下调的突变株。通过比较突变株和野生菌株之间漆酶的产生能力及降解木质素能力的差别得出较为确切的结论，即在褐腐菌降解纤维素的过程中，111314的作用是通过氧化醌类物质提供一定数量的羟基自由基，而62097是在真菌的各种应急机制中起保护作用。研究首次证明在人们普遍认为不存在漆酶的褐腐菌中确实存在着有功能的漆酶，并且证实这些新的漆酶具有很强的耐热性和耐酸性，它们的催化活性的差异也首次被揭示，这些差异对理解它们的功能提供了更多的依据。还首次对这些新的漆酶种类的表达调控和信号通路进行研究，表明不同同工酶在菌株中所起的作用有明显的不同，对理解这些同工酶在不同微环境中的作用提供了更多的数据。我们还首次构建了针对这个异合体的转化体系，尽管对基因完全敲除还很难做到，但首次构建的RNAi体系为理解111341和62097的功能提供了有力工具。