三裂叶豚草花粉新过敏原的克隆、表达及致敏性研究

Ragweed, Artemisia and Humulus are the main sources of autumn pollen allergy. In North China and Beijing, giant ragweed (Ambrosia trifida L.) is the major allergenic ragweed. Except for Amb t 5 and Amb t 8, most allergens in giant ragweed pollen are still not identified. By the second generation sequencing and mass spectrometry analysis, 7 complete nucleotide sequences and 4 partial nucleotide sequences of potential new allergens in giant ragweed pollen have been identified. Moreover, Amb t-11 had been expressed successfully and its allergencity was also studied. In this project, we will use RACE technology to obtain the complete sequences of Amb t-1, Amb t-2, Amb t-7, Amb t-10, and expressed the Amb t-1~10 proteins. The natural allergens will be obtained by affinity chromatography by polyclonal antibody of these allergens. The in vitro and in vivo allergenicities of these novel allergens were also examined. This project will give the full information about the major allergens in giant ragweed and is valuable for the further component resolved diagnosis vaccine development for giant ragweed allergy.

在我国导致秋季花粉症主要花粉来源是豚草，葎草和蒿草。我国华北及北京地区主要致敏豚草是三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.）。其过敏原只有Amb t 5和Amb t 8被鉴定出来，尚有大量的过敏原成分没有鉴定出来。前期课题组通过二代测序和质谱分析筛选出7个三裂叶豚草花粉潜在新过敏原的完整核酸序列和4个部分核苷酸序列。已对Amb t-11进行了重组表达及致敏性活性验证。在本项目中，我们将进一步采用RACE技术获得Amb t-1、Amb t-2、 Amb t-7、Amb t-10的完整序列，并重组表达Amb t-1~10。通过制备多克隆抗体，亲和层析得到天然蛋白，完成新过敏原的体内外的致敏性实验。本项目通过完善三裂叶豚草花粉主要过敏原蛋白信息，为豚草花粉过敏原组分解析诊断和进一步的个体化脱敏治疗疫苗的研制成为可能奠定基础。

过敏性疾病是临床上的常见病、多发病，其在全球的发病率也在逐年增加。 在我国，三裂叶豚草是导致花粉过敏性疾病的主要的秋季致敏物种，然而其中具体的过敏原分子信息尚不完全清楚。对此，我们在项目的前期工作中筛选到11个可能是三裂叶豚草花粉过敏原的基因序列片段，按照项目计划要求顺利进行后续研究工作。首先，我们利用基因扩增和克隆法对这些潜在过敏原分子的编码区序列进行了测序验证。利用重组表达方法制备相应的重组过敏原或免疫亲和层析技术纯化相应的天然过敏原，并进行一系列致敏性研究明确了三裂叶豚草花粉中共7个过敏原分子，属于5种不同蛋白类型：半胱氨酸蛋白酶（过敏率：33.8%~47.8%）、钙结合蛋白（过敏率：14%）、2个前纤维蛋白（过敏率：42.9%和52%）、2个超氧歧化酶（过敏率：5.6%和12%），磷酸丙糖异构酶是我们进一步从三裂叶豚草花粉中新发现的具有IgE结合活性的过敏原分子。上述成果中，三裂叶豚草花粉中的2个前纤维蛋白、1个超氧歧化酶已受到世界卫生组织/国际免疫学会联合会过敏原命名委员会（World Health Organization and International Union of Immunological Societies Allergen Nomenclature Sub-committee，WHO/IUIS）的正式命名，为Amb t 8.0101、Amb t 8.0201、Amb t 13.0101，收录在相应的数据中（www.allergen.org）。以上结果进一步完善了三裂叶豚草花粉过敏原数据库，为其分子诊断和脱敏疫苗的研制奠定了基础。本项目以第一标注在SCI收录的期刊上包括免疫学领域和过敏原研究方向期刊Allergy, Asthma & Immunology Research, Molecular Immunology等发表文章7篇，以第一标注在中国科技核心期刊发表文章4篇，在以第二标注在SCI收录的期刊上发表文章7篇，以第二标注在中国科技核心期刊发表文章1篇，以第三标注在SCI收录的期刊上发表文章3篇，共计22篇文章，均为通讯作者或共同通讯作者。