美洲大蠊新过敏原的克隆，表达和致敏性研究

Cockroaches are the second indoor allergens, except mites. American cockroach，German Cockroach and brown-banded cockroach are the main cockroaches causing allergy in China. Some allergens were reported to be identified from American cockroach. Our previous study identified another six potential novel allergens from American cockroach by allergomics method. The current project firstly clones these novel allergens by the primes designed according to the partial amino acid sequences of allergens identified by MALDI-TOF/TOF MS in American cockroach cDNA library. Then, these allergens are expressed in both E.coli and eukaryotic insect cell systems. The allergenicities of these allergens are tested by ELISA, immune-blotting, basophils activation test，skin prick and T cell proliferation assay. The identified novel American cockroach allergens can give important allergens information for the development of diagnosis reagent and vaccine for American cockroach allergy.

蟑螂是仅次于尘螨的第二大室内过敏源。我国常见的致敏蟑螂种类就是美洲大蠊，德国小蠊以及黑胸大蠊。目前已经从美洲大蠊中鉴定出多个过敏原成分。我们前期研究通过美洲大蠊过敏蛋白组学在美洲大蠊中发现到另外6个新的潜在过敏原蛋白。本项目首先根据质谱鉴定得到的潜在新过敏原部分氨基酸序列设计引物，筛选美洲大蠊cDNA文库，获得美洲大蠊潜在新过敏原基因。在大肠杆菌和杆状病毒-昆虫表达系统中表达并纯化，获得美洲大蠊潜在新过敏原蛋白。通过ELISA，免疫印迹，嗜碱性粒细胞激发试验，皮肤点刺试验研究潜在新过敏原的致敏性。综合各种致敏性实验结果，确定6个潜在过敏原是否是过敏原，并通过国际组织评估认可。从而对美洲大蠊过敏原成分信息有个全面的认识，为美洲大蠊过敏原组分解析诊断和进一步的个体化脱敏治疗疫苗的研制奠定基础。

蟑螂是室内过敏原的重要来源，与哮喘和过敏性鼻炎的发病密切相关。然而蟑螂中的致敏组分尚不完全清楚。我们此项目的前期工作中利用蛋白组学发现出6个新的潜在过敏原蛋白，按照项目计划要求顺利进行后续研究工作。首先，我们利用cDNA末端快速扩增法成功地获取其中5种美洲大蠊中编码目的蛋白的基因全长信息。利用重组克隆，成功表达和纯化目的蛋白，并通过一系列致敏性验证实验明确了美洲大蠊GAPDH、Actin、ATP synthase subunit β、Heat shock protein的IgE结合率分别为40%、33.3%、28.6%和31%。这4种新过敏原的基因全长序列信息均已录入NCBI Genbank数据库中，注册号分别为MG775273、MG775274、MN105099和MN105100，其中美洲大蠊GAPDH已由世界卫生组织和国际免疫学会联合会过敏原命名小组委员会（WHO/IUIS Allergen Nomenclature Sub-committe）评估并且命名为Per a 13。除此之外，我们还制备了每个新过敏原的多克隆抗体、分析和模拟二级结构、三维模型及潜在IgE表位序列信息。本项目以第一标注在SCI收录的期刊上包括免疫学领域和过敏原研究方向顶级期刊Journal of Allergy and Clinical Immunology、Clinical Reviews in Allergy & Immunology等发表文章13篇，以第三标注在SCI收录的期刊上发表文章1篇，以第四标注在SCI收录的期刊上发表文章1篇，共计15篇文章，均为通讯作者或共同通讯作者。