一种新型噬菌体及其裂解酶的分子生物学特征及作用靶位的生物结构

病原细菌的超强、广谱耐药性问题使得噬菌体疗法用于耐药性细菌感染的治疗成为研究的热点。噬菌体及其裂解酶可以特异性的裂解细菌，不会侵染真核细胞，也不会破坏机体的正常菌群，是新概念的抗菌物质。在前期研究中我们分离到一株对超强耐药金黄色葡萄球菌具有强裂解活性和宽裂解谱的新噬菌体，命名为GH15。其裂解酶LysGH15对该菌表现出了很强的裂解活性和更宽的裂解谱，更重要的是对耐药性菌株具有明显的偏嗜性。实验表明50μg裂解酶即可以保护菌血症小鼠模型。显示了该噬菌体和裂解酶治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染的巨大潜力。本课题应用基因组学和晶体衍射技术等系统研究该噬菌体的生物学特征及其遗传学特性；深入研究裂解酶的天然构象及其作用的分子机制；详尽解析裂解酶作用靶位的结构。从而为耐药性金黄色葡萄球菌新型模拟药物的分子设计奠定坚实的理论与实验基础，并为耐药性细菌的噬菌体及其裂解酶遗传学研究与新药研发建立基础平台。

病原细菌的超强、广谱耐药性问题已经成为威胁人类健康、公共卫生安全、养殖业健康发展的重要问题，研发全新作用机制的抗菌药物刻不容缓。噬菌体裂解酶可以特异性的裂解细菌，不会破坏机体的正常菌群，很有潜力成为新型的抗菌药物。通过该项目我们分离到一株金黄色葡萄球菌的新噬菌体——GH15，全基因组测定和分析表明其与金葡菌的K噬菌体家族成员具有较高同源性，但是GH15的基因组不存在其它同源噬菌体都具有的内含子，表现出独特的遗传特性。确定了GH15的裂解酶LysGH15，对其进行了基因工程表达，其对金葡菌、尤其是MRSA菌株表现出广谱、高效的抗菌活性，且不会诱导细菌产生抗性，对小鼠菌血症模型表现出良好的治疗效果，表现出巨大的应用潜力。LysGH15所诱导的抗体不会影响其裂解活性和体内治疗效果，首次将裂解酶LysGH15和中药单体芹菜素进行联合应用，对金葡菌能够发挥杀菌和抗毒素的双重作用，二者组成的膏剂可以有效治疗金葡菌引起的烧烫伤感染。解析了LysGH15的三维结构，其中CHAP区结合一个Ca2+，属于“EF-Hand-Like”蛋白，二者平衡解离常数为27 µM，Cys54的巯基起攻击作用，His117-E134-N136起辅助作用，Ca2+通过稳定活性口袋的构象，尤其使Cys54处于正确位置，从而在活性中起“开关”作用；Amidase-2区的H214、H324和C332的侧链结合一个Zn2+，Zn2+结合位点与E282和T330是发挥活性的关键位点；对SH3b区进行滴定实验鉴定了其与底物多肽AGGGGG相互作用的界面和关键位点（N404、Y406、G407、T408、L433和I454），将SH3b与GFP融合表达，在检测方面表现出应用潜力；综合分析，SH3b起关键的结合作用，CHAP起关键的催化作用，amidase-2起辅助催化作用，三个片段共同促成了LysGH15高效的裂解活性。该项目的研究填补了国内外对金葡菌噬菌体裂解酶三维结构方面的空白，为同源裂解酶的结构研究提供了首个可参考的结构模型，也为耐药性金黄色葡萄球菌新型模拟药物的分子设计奠定坚实的理论与实验基础，更为耐药性细菌的噬菌体及其裂解酶遗传学研究与新药研发建立了基础平台。