羊布鲁氏菌吞噬小体调控表达基因的筛选及其作用机制的研究

布鲁氏菌病（简称布病）作为主要侵害生殖系统的一种人畜共患慢性传染病流行于世界各地。近年来，我国人间和畜间布病发病率持续快速上升，防疫形势严峻。布病的致病机制是国内外研究热点，特别是吞噬小体内细菌通过多种策略进行调节使其适应环境和持续感染，是致病机制的关键环节。本研究拟以转录组学和蛋白质组学技术相结合，针对不同毒力羊布鲁氏菌感染树突状细胞、巨噬细胞、胎盘绒毛膜成纤维细胞三种不同属性细胞形成的吞噬小体成熟的差异，筛选吞噬小体调控各代谢途径和信号转导途径差异表达的基因，以cDNA代表性差异分析技术和基因表达调控技术相结合，验证并调控目的基因的表达，对相关代谢途径和信号转导途径进行人工干预，探讨布鲁氏菌的致病机制，进而筛选具有潜在抗病育种应用价值的抗羊布病育种关键基因，为抗布病转基因育种奠定基础，同时也为人布病的治疗和药物靶点的筛选奠定基础。

布鲁氏菌的致病机制是国内外研究热点，吞噬小体内细菌通过多种策略进行调节使其适应环境和持续感染是致病机制的关键环节。本研究以转录组学，针对不同毒力羊布鲁氏菌感染细胞形成的吞噬小体成熟的差异，筛选吞噬小体调控代谢途径和信号转导途径差异表达的基因，以基因干扰技术调控并验证目的基因的表达对布鲁氏菌增殖的影响，探讨了布鲁氏菌的致病机制，具体工作如下:(1)检测了B. melitensis 16M感染巨噬细胞、树突状细胞、胎盘绒毛膜成纤维细胞内吞噬小体，最终确定羊布鲁氏菌强毒菌株感染巨噬细胞系RAW264.7形成吞噬小体的时间为4h(吞噬小体和溶酶体大量形成)和24h(弱毒菌株吞噬小体被清除)作为研究羊布鲁氏菌吞噬小体调控表达基因的筛选及其作用机制最佳时间点。（2）完成羊布鲁氏菌感染巨噬细胞吞噬小体调控表达的基因的转录组学研究，通过数字表达谱测序技术(DGE)方法，对布鲁氏菌强弱毒株感染鼠单核细胞系RAW264.7后4h、24h的转录组学，获得强毒菌株感染巨噬细胞4h时，90个基因显著上调(上调1000倍以上),26个基因显著下调(下调1000倍以上)；感染后24h 至少89个基因显著上调(上调1000倍以上),39个基因显著下调(下调1000倍以上)；感染后4h组-感染后24h组之间存在差异基因3031个，对以上163个显著下调基因进行功能分析，选定Acp 5等18个基因为进一步的研究对象。（3）对差异表达基因进行了荧光定量PCR验证，建立了布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞后的差异表达基因数据库，对小鼠巨噬细胞感染布鲁氏菌后的动态转录组学轮廓进行了描述，宿主细胞对于病原菌的调节是以一个有机调控的网络在发挥作用，发现在感染后24 h内，变化显著的基因都是与炎症、免疫、吞噬、凋亡紧密相关的，进而分析了在感染后24h内显著变化的溶酶体代谢途径及被显著富集的溶酶体信号通路。（4）根据获得的部分基因序列信息,从小鼠全基因组数据库中获取目的基因的序列，设计出使该基因沉默的dsRNA,对小鼠巨噬细胞感染布鲁氏菌后上调表达的Acp 5等6个基因进行抗羊布鲁氏菌病相关基因的筛选与作用机制研究，筛选具有抑制羊布鲁氏菌吞噬小体持续存在的相关基因,发现Acp 5、Laptm 4a的调控能显著影响布鲁氏菌的胞内增殖能力，为布病的治疗和药物靶点的筛选奠定基础。