绿色气球菌噬菌体新型裂解酶AVPL的生物学特性及其跨菌种抗葡萄球菌的分子机制

The strong and broad-spectrum antibiotic-resistance of pathogenic bacteria is a serious problem that threatens the human medicine, veterinary medicine, public health and healthy farming. Thus, it is an urgent need to develop new antibacterial drugs. Phage-derived lysin is a type of antibacterial agent which can efficiently and specificly kill bacteria. However, the narrow bactericidal spectrum of lysin due to the specificity is a major constraint on affecting its therapeutic application. In our previous studies, the first phage (AVP) infecting Aerococcus viridans was isolated. AVPL, the lysin of AVP, shows less than 20% identity to all proteins in the database. What is more interesting is, besides A. viridans, AVPL also displays strong and broad-spectrum bactericidal activity against staphylococci, including Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis etc. Comparing with other phage lysins, what features does AVPL possess? How AVPL plays the cross-species bactericidal activity? To answer this question, we will further study the biological characteristics of AVPL, analyze the three-dimensional structure of AVPL, and finally reveal the molecular mechanism of its strong and broad-spectrum bactericidal activity, by crystal diffraction and molecular docking etc. The research will not only establish a basic platform for the development of new antibacterial drugs against staphylococci and A. viridans, but also provide substantial theoretical and experimental bases for the design of lysin which displays strong and broad-spectrum bactericidal activity against Gram-positive bacteria.

病原细菌的超强、广谱耐药性已成为严重威胁医学、兽医学、公共卫生和健康养殖的重要问题，研发新型抗菌药物刻不容缓。噬菌体裂解酶对细菌具有高效和特异的杀菌活性，是新概念的抗菌物质，但其特异性导致的杀菌谱单一是影响应用的关键制约因素。本课题组前期分离到国内外首个绿色气球菌的噬菌体，其裂解酶AVPL与数据库中所有蛋白的同源性均不足20%，更有趣的是，AVPL对绿色气球菌以外的多种葡萄球菌（包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等）也表现出广谱、高效的抗菌活性。那么，AVPL具有哪些独特的生物学性质，其发挥跨菌种抗菌活性的分子机制是如何实现的？为了回答该科学问题，本项目将深入研究AVPL的生物学特性，重点利用晶体衍射和分子对接等解析其三维结构、揭示其发挥广谱抗菌活性的分子机制。该项目将为针对葡萄球菌和绿色气球菌新型抗菌药物的研发建立基础平台，也为革兰氏阳性菌广谱裂解酶的分子设计奠定坚实的理论与实验基础。

病原细菌的超强、广谱耐药性已成为严重威胁临床医学、公共卫生安全和健康养殖的重要问题，研发新型抗菌药物刻不容缓。噬菌体及其裂解酶可特异性的杀灭细菌，但对细菌以外的其它生物没有危害，也不会破坏动物机体的正常菌群，是“精准型”的抗菌物质。通过本项目，在自然界中获得了国内外首个绿色气球菌的噬菌体AVP，并对其形态、裂解谱、感染的最佳MOI、一步生长曲线、pH和温度稳定性等生物学特性进行了测定，表明该噬菌体为裂解性噬菌体；基因组分析表明AVP与NCBI等数据库中其它噬菌体基因组的同源性和覆盖率极低，在进化树中处于独立的分支；该噬菌体体外对绿色气球菌杀菌效果显著，治疗研究表明其在体内对绿色气球菌引起的乳腺炎具有良好的治疗效果，表现出研究价值和应用潜力。通过原核表达实现了噬菌体裂解酶AVPL的表达和纯化，裂解酶AVPL对绿色气球菌和链球菌均具有显著的杀菌活性，且AVPL性质稳定，不诱导抗性细菌的产生，在牛奶中抗菌活性同样显著；AVPL对链球菌感染引起的小鼠乳腺炎表现出良好的治疗效果，在防控链球菌方面显示出应用潜力。通过分析和建模获得了裂解酶AVPL的N端amidase催化域和两个C端LysM结合域的蛋白质三维结构，通过位点突变分析和活性验证确定了各活性域发挥活性的关键位点，所构建的结合域与GFP的融合蛋白可特异性结合绿色气球菌和链球菌，在检测方面显示出潜力。鉴定了绿色气球菌能发挥广谱抗菌活性的乳酸氧化酶，首次发现该酶可以通过氧化乳酸产生过氧化氢从而发挥广谱抗菌活性，且该酶在体内治疗实验中同样具有显著的效果。综上，本项目获得的噬菌体AVP和裂解酶AVPL在防控绿色气球菌和链球菌感染方面潜力巨大，首次提出利用乳酸氧化酶可作为广谱抗菌的新策略，为耐药细菌的治疗和防控提供了新的思路。