PSMA5在奶牛乳腺上皮细胞内源性合成共轭亚油酸过程中的作用和调节通路研究

Conjugated linoleic acid(CLA) is functional fatty acid in the milk, and the endogenous synthesis of CLA from trans-vaccenic acid (TVA;trans-11 C18:1) via the major CLA synthesis pathway in ruminants. However, the mechanisms involved in the synthesis of CLA in the mammary gland in response to TVA are not well understood. In previous study we found that PSMA5(proteasome subunit, alpha type 5) was highly expressed in goat mammary tissue and bovine mammary epithelial cells when TVA is converted into CLA. In this study we using gene over expression and RNA interference technology, to research on the effect of PSMA5 in CLA synthesis in bovine mammary epithelial cells. And using quantitative real-time PCR detection PSMA5 influence SCD, ACC, FAS and SREBP-1c etc. fatty acid synthesis regulated gene expression.Then the proteomics analysis tools is used to screen the differentially expressed proteins during endogenous CLA synthesis in the PSMA5 gene over expressed or PSMA5 gene silenced mammary epithelial cells, and to build PSMA5 related regulation protein signal pathway. The results help to reveal the mechanism of PSMA5 regulate CLA synthesis in mammary tissue, and for the use of molecular nutrition means regulation the synthesis of CLA in mammary tissue provides the theories foundation.

共轭亚油酸(CLA)是牛奶中的功能性脂肪酸，主要通过反式异油酸在乳腺组织中内源性合成而来，但是其在乳腺中的合成机制尚未明确。我们前期研究发现在奶山羊乳腺组织CLA合成过程中蛋白PSMA5表达上调，并且在奶牛乳腺上皮细胞中PSMA5表达也是上调。本项目利用基因过表达和沉默技术，研究PSMA5对奶牛乳腺上皮细胞中CLA合成的作用，并利用荧光定量PCR技术检测PSMA5对SCD、ACC、FAS、SREBP-1C等脂肪酸合成调控基因的影响；利用蛋白组学方法，寻找在PSMA5基因过表达和沉默的乳腺上皮细胞合成CLA过程中有表达差异变化的蛋白，并明确与PSMA5相关的调控蛋白信号通路。研究结果有助于揭示PSMA5调节乳腺组织中CLA合成的机制，为利用分子营养学手段调控乳腺中CLA的合成提供理论基础。

共轭亚油酸(CLA)是牛奶中的功能性脂肪酸，主要通过反式异油酸（TVA）在乳腺组织中内源性合成而来，但是其在乳腺中的合成机制尚未明确。我们前期研究发现在奶山羊乳腺组织CLA合成过程中蛋白PSMA5表达上调，并且在奶牛乳腺上皮细胞中PSMA5表达也是上调。本项目研究PSMA5的基因过表达或抑制对奶牛乳腺上皮细胞中CLA合成的影响，并利用荧光定量PCR技术检测共轭亚油酸合成关键基因SCD的表达变化。在PSMA5过表达研究中，发现在MAC-T的分化诱导过程中添加1mM或5mM浓度的氯化锂，可以显著提高PSMA5的基因表达（P<0.01），当添加浓度提高到10mM时，极显著提高PSMA5和SCD的表达（P<0.01）。通过本次研究，首次发现不同浓度的氯化锂可以调控MAC-T细胞中PSMA5基因的高表达，并且也可以诱导SCD基因高表达。在进行PSMA5基因干扰的研究中，成功构建了PSMA5干扰载体。对MAC-T细胞进行PSMA干扰处理后，分化诱导90小时，处理不同浓度的TVA（30μM、50μM、100μM）研究对共轭亚油酸合成的影响。在2小时发现PSMA5干扰载体成功抑制了MAC-T细胞中PSMA5基因的表达。在4小时和6小时，不同浓度的TVA处理下，干扰组与对照组相比PSMA5基因基本保持一致。这说明随着TVA处理浓度和时间的增加，PSMA5干扰载体一直抑制了细胞内PSMA5基因的表达。另一方面，PSMA5基因的抑制反而提高了MAC-T细胞中SCD基因的表达，并且随着TVA添加的浓度和时间的增加细胞内SCD的表达量持续高表达。对30μM浓度TVA处理2小时的细胞进行收集，分析脂肪酸含量。气相分析结果显示，PSAM5干扰载体中TVA合成共轭亚油酸的含量极显著高于空载体对照组（P<0.01），这与PSMA5干扰后SCD表达量增加结果相一致。说明PSMA5基因的干扰可以提高乳腺上皮细胞中SCD的表达量，并且提高TVA在MAC-T细胞中内源性合成共轭亚油酸的含量。综上研究表明，PSMA5作为20S蛋白酶体的组成部分，在正常的乳腺上皮细胞内源性共轭亚油酸合成过程中下调SCD基因的表达，当对PSMA5基因进行干扰后可以提高乳腺上皮细胞MAC-T中SCD的基因表达，并且在TVA处理下可以进一步提高乳腺上皮细胞中共轭亚油酸的合成能力。