利用融合性多肽靶向核酶Artemis增强肿瘤放射敏感性的作用及机制研究

Being the key pathway for irradiation-induced DNA damage repair, the NHEJ signaling pathway is the main mechanism for tumor radioresistance. Artemis, a phosphorylated protein with nuclease activity, plays a critical role in NHEJ pathway by binding with DNA-PKcs and DNA-LigaseⅣ successively and triggering the accompanying phosphorylation. In our study, we designed and synthesized various small peptides involving the binding sites of Artemis with DNA-PKcs or DNA-LigaseⅣ, and then combined them to a penta-peptide of CNGRC, which is able to localize tumor blood vessels and penetrate cell membrane. We studied the biological activity of the fusion polypeptide by taking into account its capability to enter nuclei, the intracellular metabolic kinetics, and its effects on cellular radiosensitivity and NHEJ efficiency. We then investigated fusion peptides’ blockage action on Artemis’s binding with DNA-PKcs or DNA-LigaseⅣ as well as their tumor radiosensitization effects, and explored the associated molecular mechanisms in vitro. Furthermore, we examined the tumor targeting and radiosensitization effect of the fusion peptides on transplanted tumor tissuses, thereby defining tumor radiosensitization potentiality of the peptides and laying the basis for developing new clinical tumor radiosensitizers.

NHEJ通路是电离辐射诱导的DNA损伤修复的关键通路，是肿瘤放射抵抗的主要机制。核酶Artemis通过与DNA-PKcs、DNA-LigaseⅣ的相继结合及伴随的磷酸化过程在NHEJ通路中发挥关键作用。本研究中，通过设计合成包含Artemis与DNA-PKcs、DNA-LigaseⅣ结合位点的肽段，并将其与具有肿瘤血管定位及穿胞能力的环形五肽CNGRC融合形成小分子融合多肽，首先研究融合多肽的生物学活性包括融合多肽对肿瘤细胞核的定位能力及细胞内代谢动力学，多肽对细胞放射敏感性及NHEJ修复效率的影响，然后研究多肽对Artemis与DNA-PKcs、DNA-LigaseⅣ结合的阻断作用等与其作用相关的细胞及分子机制，并进一步研究靶向融合多肽在体内实验中对移植瘤组织的靶向性和放射增敏效果，从而明确靶向Artemis的小分子融合多肽对肿瘤的放射增敏能力，为临床开发新的放射增敏剂建立基础。

Artemis、DNA-PKcs和DNA Ligase IV在DNA非同源末端链接修复通路中发挥重要作用，抑制其活性可增强细胞放射敏感性，是开发新的分子靶向放射增敏剂的有效研究方向。因此，我们提出假说：通过抑制Artemis和DNA-PKcs以及DNA Ligase IV的相互作用可有效提高肿瘤细胞的放射敏感性。本研究中，我们合成靶向Artemis和DNA-PKcs以及DNA ligase IV结合的两条融合多肽（BAD和BAL），通过克隆存活实验研究融合多肽的放射增敏效果；应用Western blot和免疫荧光技术分析DNA修复能力；应用流式细胞仪检测细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡；构建荷瘤小鼠，进而研究融合多肽在体内的放射增敏效果。我们的数据证实融合多肽BAL通过抑制DNA损伤修复通路发挥放射增敏作用，与放射治疗可协同抑制细胞增殖，阻滞细胞周期以及促进细胞凋亡，并都依赖于DNA ligase IV发挥功能。最终，我们将融合多肽BAL应用于荷瘤小鼠模型中并证实该多肽在体内具备放射增敏作用。综上所述，我们设计并合成一条新的放射增敏剂，其通过抑制Artemis和DNA Ligase IV的相互作用发挥功能，且我们对其在体内的安全性有所评估，将为后续开展更多体内应用研究提供基础。本研究对于开发新的放射增敏药物，提高临床上肿瘤放射治疗效果，改善肿瘤患者预后具有重要意义。