植物乳杆菌Y44清除活性氧关键基因及其作用机理研究

Some Lactobacillus strains can alleviate the host reactive oxygen species injuries induced by high-fat food, but the mechanism is not clear. In previous study, Lactobacillus plantarum Y44 and other lactobacilli strains could scavenge free radicals. Furthermore, the strain Y44 could tolerate H2O2 and protect HT-29 cells against injury induced by H2O2 more significantly than other lactobacilli strains. However, the key protein of the strain Y44 involved in oxygen reactive species scavenging is not clear. The project aims to investigate the transcriptional level variation related with reactive oxygen species scavenging between the strain Y44 and control strains by whole genome sequencing and RNA-seq, and find the up-regulated genes and proteins related with antioxidant; to structure a genetically engineering strain deleting the up-regulated genes, and verify the antioxidant function of the genes; to study the mechanism by which the strain Y44 alleviate injuries in animal model fed by high-fat diet. To find the key genes involved in reactive oxygen species scavenging of the strain Y44 and offer the support to set up a high-throughput method screening Lactobacillus strains with antioxidant activities.

某些乳杆菌属细菌可缓解高脂膳食等因素对机体造成的活性氧损伤。在氧胁迫下乳杆菌清除活性氧的机制仍不明确，采用不同化学方法研究菌株的抗氧化活性也存在较大差异。前期研究发现植物乳杆菌Y44与对照菌株均可清除自由基，但菌株Y44对过氧化氢的耐受性和保护HT-29细胞免受过氧化氢损伤的效果更显著，但菌株Y44参与活性氧清除的关键蛋白并不清楚。本课题拟对菌株Y44及对照菌株进行全基因组和氧胁迫条件下转录组测序，分析菌株Y44和对照菌株在氧胁迫条件下基因转录水平差异，筛选与抗氧化活性相关且表达水平较高的差异基因及其编码蛋白；通过基因敲除和基因回补技术确定菌株Y44差异基因清除活性氧的功能；研究菌株Y44及其差异基因缺陷型菌株对高脂膳食饲喂小鼠生理机能的影响，阐明该菌株缓解高脂膳食对机体活性氧损伤的机理。从而明确与菌株抗氧化活性相关的关键基因和蛋白，为建立筛选抗氧化功能菌株的高通量方法提供理论支持。

本课题研究了一株植物乳杆菌耐受活性氧及缓解活性氧对机体损伤的功能和机理。Lactobacillus plantarum Y44具有氧自由基吸收能力、细胞抗氧化能力、对H2O2以及 AAPH的活性氧胁迫具有耐受性，并通过降低HT-29细胞Bax/Bcl-2表达量比例和Hsp70表达量，缓解H2O2对HT-29细胞造成的活性氧损伤。L. plantarum Y44在模拟胃肠液中具有较好的生存率，并具有一定的黏附能力，在生长过程中代谢产生胆盐水解酶，不具有溶血性、对抗生素敏感、不具有产生物胺的能力，是一株安全的菌株。L. plantarumY44的完整基因组包含3.25 M bp的单个环状染色体和0.05 M bp单个环状质粒，共含有3 293个基因，包括3 112个蛋白质编码序列、16个rRNA、66个tRNA、4个sRNA和95个假基因。L. plantarumY44基因组编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）系统编码、谷胱甘肽（GSH）系统编码、硫氧还蛋白系统以及活性氧胁迫损伤修复系统，有助于L. plantarumY44提高耐受活性氧胁迫能力。L. plantarumY44基因组未鉴定到毒力基因、获得的抗生素抗性基因和氨基酸脱羧酶基因，表明L. plantarumY44具有较好的安全性。在AAPH胁迫下，L. plantarumY44的基因和蛋白表达水平发生变化。L. plantarum Y44通过促进肽聚糖生物合成、磷壁酸D-丙氨酰化、加速芳香族氨基酸的生物合成、调节脂肪酸组成、从而重塑细胞表面，提高L. plantarum Y44耐受活性氧胁迫能力。对皮下注射D-gal的Balb/c 小鼠灌胃L. plantarumY44可以恢复D-gal引起的小鼠肠道菌群失衡，维持肠道屏障功能，调节甘油磷脂代谢，激活 Nrf-2/ Keap-1通路，提高抗氧化酶活性，缓解宿主活性氧损伤。不同浓度的L. plantarum Y44干预高脂膳食小鼠，L. plantarum Y44可通过调节高脂膳食小鼠肠道菌群，缓解高脂膳食小鼠的肠道炎症；促进高脂膳食小鼠肠道内短链脂肪酸的产生进而缓解高脂膳食小鼠的脂代谢紊乱。L. plantarum Y44是一株可以缓解活性氧对机体造成氧化损伤的益生菌。