植物乳杆菌素的分离鉴定、基因克隆、高效表达和抑菌机理研究

Bacteriocins are ribosomally synthesized proteinaceous toxins produced by bacteria to inhibit the growth of similar or closely related bacterial strains. In contrast to antibiotics, which are synthesized by multistep enzymatic pathways, bacteriocins are safe, stable and could specifically kill pathogens. Therefore, bacteriocin is ideal alternative to antibiotics. A plantaricin producing strain Lactobacillus plantarum YJG was isolated from the intestinal tract of chicken by our group. Through a series of studies, the plantaricin produced by YJG was proved to be able to inhibit many Gram positive and negative bacteria, and even some fungi. The results of preliminary experiments showed that addition of plantaricin produced by YJG into the feed of layer leaded to egg production improvement, reduction of the feed to egg ratio and egg weight increase. This study was mainly focuced on the isolattion, purification and characterization the plantaricin produced by YJG, then the N-terminal sequence of the plantaricin will be determined by Edman degradation and the amino acid sequence of the other part will be determined by LC/MS/MS. Base on the amino acid sequence, the plantaricin gene will be cloned from YJG and recombinant strain overexpressing this gene will be constructed. At last the antimicrobial mechanism of the plantaricin will be explored.

细菌素是由某些细菌通过核糖体合成的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质。细菌素因自身优良的抗菌特性和安全性成为了解决抗生素的药物残留及细菌耐药性问题的理想替代品。植物乳杆菌产生的细菌素抑制近缘菌，同时抑制一些致病性革兰氏阳性菌、阴性菌。申请者实验室从鸡肠道中分离到1株对常见病原菌具有良好抑制作用的植物乳杆菌YJG。YJG所产植物乳杆菌素可抑制革兰氏阴性菌和阳性菌及部分真菌菌株，对同源的乳酸菌菌株无抑制作用。前期的实验结果表明YJG所产植物乳杆菌素能提高蛋鸡的产蛋率和降低料蛋比。本项目将对该植物乳杆菌素进行分离纯化及特性研究；应用Edman降解法及LC/MS/MS测定植物乳杆菌素的氨基酸序列；克隆其基因并构建高效表达植物乳杆菌素的基因工程菌；研究该植物乳杆菌素的基因调控及抑菌机制；同时研究植物乳杆菌素和植物乳杆菌抑制病原菌黏附肠上皮细胞之间的关系，为研发高效、安全的细菌素饲料添加剂提供理论基础。

肽类细菌素是通过核糖体途径产生的具有抗菌活性的多肽和蛋白类物质，相对传统的抗生素，抗菌肽具有安全性高、稳定性高、无残留及抑杀病原菌等优良特性，是抗生素替代品的理想选择，但野生菌细菌素产量通常有限，而外源表达可以有效提高表达量。本研究从实验室前期分离鉴定的一株植物乳杆菌CAU 6001中克隆出编码细菌素plantaricinE，-F（PlnE，-F）的基因plnE，-F，根据大肠杆菌和毕赤酵母的密码子偏好性及载体克隆位点等信息进行了细菌素PlnE，-F的基因设计与合成，分别将PlnE，-F的基因与pLpp-ompA和pPICZαA连接构建重组载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X33,在大肠杆菌和毕赤酵母中分别实现了周质空间表达和胞外分泌表达，且表达产物对金黄色葡萄球菌等指示菌有明显抑菌活性。经过浓缩、镍柱等纯化步骤，最终获得的重组细菌素PlnE，-F，在大肠杆菌和毕赤酵母中的产量分别为1.54 mg/L（PlnE）、1.85 mg/L（PlnF）和35.43 mg/L（PlnE）、40.25 mg/L（PlnF）。.纯化后重组细菌素有明显的抑菌作用，且PlnE的作用好于PlnF，但PlnE,-F对pH和温度的耐受较低。经过溶血试验和细胞毒性试验表明，重组肽PlnE,-F的细胞毒性和溶血性较低，并且能够有效抑制病原菌粘附人肠道上皮细胞Caco-2。. 由于PlnE的高温耐受力较低，本项目结合数据库中抗菌肽相关信息及本实验室的研究基础，以PlnE和肠道抗菌肽RELMβ为模板肽，设计合成了杂合肽E-RELMβ，E-RELMβ基因经过密码子优化后，与pET28a（+）载体相连，转化大肠杆菌BL21(DE3)，重组表达后，经过细胞破碎、镍柱纯化和重折叠，得到了重组肽E-RELMβ，表达量为194.76 mg/L，与PlnE相比，、E-RELMβ具有更好的抑菌活性。以上研究结果表明，本项目成功进行了抗菌肽的异源表达，且有较好的抑菌活性和抑制病原菌粘附细胞的作用，根据PlnE的特性，设计合成了E-RELMβ，为高效表达和纯化重组细菌素和抗菌肽提供了具体的表达系统方法的参数与理论依据，为抗生素替代品的开发提供了新思路、新方法、新技术。