基于新型杂合金属亲和色谱介孔材料的磷酸化蛋白质组定量新方法研究

Label-free quantitative method is a future direction of quantitative phosphoproteomics which is worthy of study and owning potential application. The main problems of this method are poor reliability, how to simplify the sample processing, improve the enrichment efficiency and coverage of phosphorylated peptide, and enhance the sensitivity, accuracy and reproducibility of quantitative results, is still the key problem of label-free quantitative method used in phosphoproteomics. This project intends to design and synthesis a new type of hybrid metal affinity chromatography mesoporous material. Firstly, the large specific surface area of mesoporous structure was used to form a temporary "immobilized enzyme reactor", which can greatly improve the enzymatic efficiency. Secondly, the metal oxidation and metal ions binding on the surface can combine the advantages of different enrich mechanism of affinity chromatography which can greatly improve the enrich coverage, capacity and the sensitivity of the phosphorylated peptides. The material integrates the enzymatic hydrolysis and phosphorylated peptide enrich process, and finish the pre-treatment process in one step, which effectively avoid the loss of phosphorylated peptide during enrichment and solves the problem of poor reliability of label-free quantitative. This project plans to use the synthesized material in label-free quantitative method to establish an integrated sample processing to realize rapid and accurate quantitative analysis of phosphorylated proteome, and provide a novel quantitative analysis strategy for phosphorylated proteomics research.

非标记定量法是磷酸化蛋白质定量极具研究价值和应用潜力的发展方向，该方法目前存在的主要问题是可靠性差，如何简化样品处理流程，大幅提高磷酸化肽段的富集效率和覆盖面，并改善非标记定量的灵敏度、准确度和重复性，是磷酸化蛋白质组非标记定量研究有待解决的核心问题。申请人拟构建一种新型杂合金属亲和色谱介孔材料，介孔结构具有大的比表面积和临时“固定化酶反应器”作用，能大大提高酶解效率；且表面键合的金属氧化物和金属离子杂合了不同亲和色谱富集机理，提高了磷酸化肽段的富集面、富集容量和灵敏度。该材料整合了酶解和磷酸化肽段富集过程，可一步完成样品前处理过程，有效解决了由于磷酸化肽段富集过程样品损失造成非标记定量可靠性差的问题。申请人计划将该材料结合非标记定量法，建立“集成式”样品处理方法，从而实现磷酸化蛋白质组的快速准确定量分析，为磷酸化蛋白质组研究提出全新的定量分析策略。

蛋白质的可逆磷酸化是生物体内最重要的翻译后修饰之一，磷酸化蛋白组学的研究不仅是分子生物学等基础研究领域的热点，而且对阐明疾病发病机制、疾病生物标志物的寻找和新药研发具有重要的应用价值。非标记定量法在磷酸化蛋白组学研究中具有良好的前景，但目前该方法的主要缺陷在于磷酸化蛋白质酶解、富集等前处理步骤过多，从而影响结果的可靠性，限制了其应用。因此，我们将磷酸化肽段富集中常用的两种富集策略IMAC和MOAC相结合，构建了Fe3O4@mSiO2/TiO2-Ti4+，将IMAC和MOAC的富集位点Ti4+和TiO2键合在同一基质上，一次性实现这两种方法的串联，实现了多磷酸化肽段和单磷酸化肽段的同步富集；并合成和比较了不同孔径对于酶解速度的影响，探索了酶解和富集体系的转化条件；结合质谱，建立了“集成式”磷酸化蛋白质组非标记定量分析法，并对线性、准确度、精密度等方法学进行了考察，结果表明，该方法线性、准确度、精密度符合定量要求，可用于磷酸化蛋白质组定量分析，最终在同一体系里实现了蛋白酶解和磷酸化肽段富集，解决了非标记定量法用于磷酸化蛋白质组研究可靠性差的问题；并进一步研究了抗肿瘤药CPUD01对非小细胞肺癌的作用机制，通过对亚器官细胞核的给药前后差异磷酸蛋白质组研究，发现了α-烯醇化酶、二型拓扑异构酶、DHX9和谷氨酰脯氨酰tRNA合成酶这4个作用网络节点蛋白，不仅显示了我们所构建的Fe3O4@mSiO2/TiO2-Ti4+及基于此材料建立的“集成式”磷酸化蛋白质组非标记定量分析法在磷酸化蛋白质组研究中的应用潜力，也为抗肿瘤药CPUD01的开发和应用提供了依据。