基于人工杂合高亲和泛素结合蛋白的肝癌转移复发蛋白质泛素化失调分子机制的定量泛素化蛋白质组研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most commonly present human malignancies worldwide. Metastasis and relapse of HCC hinder the therapeutic effect severely, but we know little about the underlying mechanisms. Ubiquitin is a small protein-like signaling molecule. Ubiquitination is one of the most common post-translational modifications, regulating protein degradation, localization, transportation, DNA repair, and enzymatic activity. It has been known that ubiquitination is closely related with the development, progression and metastasis of HCC. As for our knowledge, there is no ubiquitome study in this field. In this application, based on the state-of-the-art ubiquitome technology recently developed in our lab, we will systematically investigate the ubiquitome of MHCC97L, MHCC97H and HCCLM6 cells originated stepwisely from one Chinese HCC patient. We can construct a HCC related ubiquitome database, identify and elucidate the molecular mechanisms of dysfunctional ubiquitylated proteins involved in metastasis of HCC to support precision medicine of HCC in the near future.

肝癌在我国发病率高，危害大。肝癌后期的转移复发是影响肝癌预后和疗效的主要因素，其机制亟待研究。泛素是真核生物体内广泛存在的蛋白质性质的信号分子。蛋白质泛素化引导着蛋白质降解、细胞内定位、转运、DNA修复、酶活力调控等几乎所有的生物学功能，并与肝癌的发生、发展和转移复发关系密切，但尚无泛素化蛋白质组学的研究报道。本申请依托申请人团队新近发展的高效无偏性人工杂合泛素结合蛋白ThUBD及其配套的泛素化蛋白富集技术，建立大规模泛素化蛋白质组高效研究技术体系，系统定量比较中国人遗传背景的系列转移潜能逐步增加的肝癌细胞系MHCC97L、MHCC97H和HCCLM6的泛素化蛋白质组，建立人肝癌相关泛素化蛋白质及其修饰位点数据库，鉴定并验证肝癌转移相关的泛素化失调蛋白，阐明其累及的修饰位点及其信号通路，揭示肝癌转移调控泛素化相关的分子机制，为肝癌预后和个性性诊治提供数据支持。

我们前期系统筛选了不同蛋白质来源的泛素结合蛋白结构域（UBD），遴选出潜在对泛素高亲和的UBD，进而利用重组蛋白筛选对所有7种泛素链高亲和的UBD，并通过不同UBD之间的互补效应，在国际上率先开创了对所有7种泛素链亲和力高偏性小的人工杂种UBD（ThUBD）。依托这个ThUBD，我们开发了高效的泛素化蛋白富集技术。在项目支持下，我们按照计划进一步成功优化了GST-ThUBD的表达和纯化工艺，得到电泳纯的GST-UBD，实现了GST-ThUBD基因工程大肠杆菌高效表达和高纯度纯化。在此基础上进一步优化了基于高效无偏性人工杂合泛素结合蛋白ThUBD的泛素化蛋白富集技术，与非ThUBD亲和富集相比，所鉴定的候选泛素化蛋白数目增加了近一倍，差异蛋白集中在整合素信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路以及RhoGDI信号通路等与细胞侵袭转移相关的信号通路以及ERK/MAPK、AKT等细胞内信号转导通路。对Hep3B、97L、97H和LM6四组细胞系共同鉴定到的蛋白数为2569个，而HCC-LM6细胞只鉴定到1158个，而LM6细胞多聚泛素化水平显著高于其他三种细胞系，推测LM6未鉴定到的蛋白可能被泛素蛋白酶体系统降解，而这些特异性的降解可能与LM6的高度侵袭转移能力相关密切。对LM6细胞缺失的这1411个蛋白进行生物信息学分析，发现这些蛋白主要聚类于DNA错配修复、氧化磷酸化、脂肪酸代谢等疾病相关通路，和癌症、细胞凋亡、分子转运、脂类代谢等紧密相关。这与LM6细胞系的高转移潜能和高度多聚泛素化直接关联。本研究所建立的人肝癌相关泛素化蛋白质及其修饰位点数据库，为肝癌转移调控泛素化相关的分子机制、肝癌预后和个性诊治提供原始数据和原创性成果支撑。在研究中针对泛素保守，适用的抗体难于获取难题，在项目支持下，我们开发了基于ThUBD特异高效亲和特性的Far Western Blot技术，特异性好，灵敏度提高4倍以上，且避免了泛素抗体对不同泛素链的严重偏性，成为针对所有泛素链类型普适的探针。