TGF-β1诱导醛糖还原酶表达在狼疮性肾炎发病中的作用与机制研究

Glomerularsclerosis is final pathological changes in lupus nephritis. Aldose reductase (AR) is a member of the NADPH-dependent aldo-keto reductase superfamily, the rate-limiting enzyme in polyol pathway. Our previous group has found that aldose reductase gene was one of TGF-β1-responsive gene by SSH-PCR. Aldose reductase have been reported to participate in extracellular matrix (ECM) proteins accumulation during glomerularsclerosis. Glomerularsclerosis is related to oxidative stress and ROS can active a large number of signaling pathways,thus to exacerbate the tissue injury.The transcription factor, Nrf2, is one of the activated pathways and its activation would accelerate the generation of ROS and ECM deposition.Nrf2 enters into the nucleus, binding to specific DNA sequences and inducing the expression of downstream genes.Here, we present our hypothesized that ROS are involved in TGF-β1 fibrosis, Nrf2 is also a bridge in the development process of glomerularsclerosis.In this study we used molecular biologic technologies cell culture, and renal needle biopsy to examine the expressin of TGF-β1 and AR in glomerulosclerosis and the relations between them, and to elucidate TGF-β1 induced expression of aldose reductase in vitro and vivo. These studies will demonstrate the regulation of AR by TGF-β1 is induced by TGF-β1 stimulation of ROS, which activates the Nrf2-ARE pathway allowing Nrf2 to directly increase AR expression in HRMCs and to find out an effective and feasible therapy for retard progression of lupus nephritis.

肾小球硬化是狼疮性肾炎(LN)发展到晚期的病理改变。醛糖还原酶(AR)是多元醇通路中的限速酶，本课题组前期研究发现AR是系膜细胞中TGF-β1下游反应性基因之一，参与了TGF-β1引起肾小球硬化的过程，但TGF-β1调控AR表达的作用机制却未阐明。肾小球硬化和氧化应激关系密切，ROS可以激活多个加剧组织损伤的信号通路，Nrf2就是其中之一，活化的Nrf2可以诱导其下游基因AR的表达。由此我们推断，ROS和Nrf2通路可能参与了TGF-β1诱导的AR表达，启动了HRMC增殖的程序。本项目拟采用Westernblot，免疫组化，以及ESR技术、转染、RNA干扰、报告基因、ChIP等实验方法，从体外(细胞系)及体内(临床肾穿标本)两方面验证AR参与了TGF-β1引起的LN肾小球硬化的发展过程，确定ROS和Nrf2在此过程中的作用，以期能够为减缓LN发展进程等研究提供重要的实验依据和理论基础。

1. 项目背景、主要研究内容及科学意义.肾小球硬化是狼疮性肾炎(LN)发展到晚期的病理改变。醛糖还原酶(AR)是多元醇通路中的限速酶，本课题组前期研究发现AR是系膜细胞中TGF-β1下游反应性基因之一，参与了TGF-β1引起肾小球硬化的过程，但TGF-β1调控AR表达的作用机制却未阐明。肾小球硬化和氧化应激关系密切，ROS可以激活多个加剧组织损伤的信号通路，Nrf2就是其中之一，活化的Nrf2可以诱导其下游基因AR的表达。由此我们推断，ROS和Nrf2通路可能参与了TGF-β1诱导的AR表达，启动了HRMC增殖的程序。本项目拟采用分子生物学和组织学等实验方法，从体外及体内两方面阐明AR是影响LN肾小球硬化、纤维化的主要因素之一；明确TGF-β1通过激活ROS和Nrf2信号通路，上调了AR的表达，启动了HRMC增殖的程序，引起肾小球硬化的发展过程，以期能够为减缓LN发展进程等研究提供重要的实验依据和理论基础。.2. 重要结果.1) TGF-β1可以诱导HMC表达AR的增加；随着TGF-β1作用时间的延长和剂量的增大，AR的基因表达水平、蛋白表达和AR活性水平均增强，与作用时间和剂量呈正相关。.2) TGF-β1可以诱导HMC产生ROS的增加；随着TGF-β1作用时间的延长和剂量的增大，ROS数量发生变化，在30min内达到最多，与TGF-β1剂量呈正相关；.3)TGF-β1可以诱导HMC表达Nrf2的增加，随着TGF-β1作用剂量的增大，Nrf2的蛋白表达水平逐渐增高，与TGF-β1作用剂量呈正相关；加入外源性ROS刺激HMC，Nrf2的蛋白表达水平增高。4) 抗氧化剂SOD、NAC能够抑制TGF-β1诱导ROS的生成增多，进而抑制TGF-β1诱导AR 基因水平、蛋白表达水平的增高和AR活性的增强。5) SOD、NAC和Nrf2 siRNA可以有效干扰Nrf2的表达，下调Nrf2表达能够抑制TGF-β1诱导的AR 基因水平、蛋白表达水平的增高和AR活性的增强。6) 双荧光素酶报告系统检测Nrf2对AR启动子转录活性的影响；明确了Nrf2可以上调AR蛋白的表达，其蛋白表达量在转染Nrf2的细胞中升高，证明了Nrf2是通过调控AR启动子区ARE序列发挥作用的；7）免疫组化染色的方法检测AR、SOD、Nrf2在LN中的表达增强。