新型反义寡核苷酸调控BMSCs的端粒酶选择性剪接对rTMS治疗血管性痴呆增敏效应的研究

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有向神经元细胞分化的能力，但存在分化能力逐代减弱问题，影响其发挥治疗作用，这与细胞内端粒酶活性和端粒长度高度相关。端粒酶逆转录酶（TERT）的促端粒酶生成功能倍受关注已有多年，但TERT表达多种形式的转录本产物，其功能及TERT剪接模式调控端粒酶活性的分子机制仍不清楚。我们在前期工作中发现， BMSCs移植和重复经颅磁刺激（rTMS）对血管性痴呆（VD）的学习记忆均有恢复作用。本项申请将进一步研究增加BMSCs中的端粒酶活性对rTMS治疗VD的增敏效应，特别是采用新型反义寡核苷酸转染、截短型TERT基因导入和RNA干扰等技术，研究调控TERT剪接模式及增加端粒酶活性对抵抗BMSCs衰老凋亡和上调神经营养（生长）因子表达等的影响。预期结果将进一步阐明端粒酶的促BMSCs神经保护分子机制，为VD的治疗提供新的思路和可能具有实用价值的分子靶标。

血管性痴呆（VD）是脑血管病所致脑损害引起的智力障碍，其治疗方法研究在不断探索之中。BMSCs是骨髓内除造血干细胞之外的一类干细胞，在一定诱导条件下，可向神经元细胞分化；有取材方便、体外易培养、增殖快、免疫原性较弱等优点。有研究报道，移植BMSCs能促进大鼠缺血脑组织血管新生以及脑组织重塑。然而BMSCs在应用中经常会出现分化能力丧失、过早老化、增殖状况不稳定等生物学现象，影响其发挥神经保护功能，这与其端粒酶活性的不足有关。TERT的促端粒酶生成功能倍受关注已有多年，但TERT表达多种形式的转录本产物，其功能及TERT剪接模式调控端粒酶活性的分子机制仍不清楚。我们在前期工作中发现，BMSCs移植和rTMS对VD的学习记忆均有恢复作用。. 课题组应用ESEfinder软件预测了hTERT外显子剪切增强子（ESEs）的位点，选择其中的第5到第9外显子间的序列作为主要研究对象，对hTERT外显子剪接增强子进行预测。这些被预测的ESE的发现，有助于针对其序列设计相应互补序列的AO，为实现hTERT外显子跳跃，调控hTERT选择性剪接和端粒酶活性提供依据。应用软件CELLO、WoLF PSORT预测TERT选择性剪接变异体的亚细胞分布主要定位在细胞核和细胞质，细胞膜上也有定位。全长hTERT mRNA才有激活端粒酶的功能，α 缺失ASV和γ 缺失ASV可能对端粒酶活性有负性调节作用，β 缺失ASV无端粒酶逆转录酶的活性。课题组研究了BDNF和TERT联合转染的BMSCs对VD大鼠学习记忆功能恢复的作用。研究结果发现，BDNF-TERT联合转染BMSCs较普通的BMSCs对VD有更好的治疗效果，可明显改善VD大鼠的学习记忆功能的恢复。课题组研究了rTMS预处理对VD大鼠认知功能影响，并探讨rTMS对VaD神经预保护的分子机制。我们推测，rTMS对VD有神经预保护作用，其机理可能与rTMS能增加大鼠海马CA1区BDNF、TrkB和SYN的表达有关。课题组还研究了NGF和TERT联合转染的BMSCs移植和rTMS对VD大鼠学习记忆功能恢复有协同增敏效应。. 项目按原计划完成各项预定内容，共发表论文6篇，其中SCI收录3篇，中文核心期刊1篇。