异常汉逊氏酵母产酯代谢关键基因筛选和分子机制研究

A high yield ethyl acetate strain of Hansenula anomala was screened,ethyl acetate is the main flavor component in the Xiaoqu liquor, its content affects the rate of excellent wine.This study intends to build the genomic library of Hansenula anomala using a shuttle vector in E.coli and yeast, then establishs the pools of the genomic library with mini-transposon, next, the purified plasmids are individually digested with restriction endonuclease and used to transfect Hansenula anomala with Leucine auxotrophic (Leu-) in order to recombine the plasmids with Hansenula anomala genomes homologously. Electing the recombinants through cultivation, and Analysis of the fermentation product by modern chromatography, can get the tag insertion mutant library.Analysing of the transposon tagging insertion sites near the area can locate the transposon insertion sites in the genome. Screening key gene of produced ester metabolic of Hansenula anomala, to analyze the molecular mechanisms of Hansenula anomala metabolism to produce ethyl acetate, and further analyze its main metabolic pathways, in order to find the method of regulation, promote the development of Xiaoqu liquor.

前期研究从小曲中选育出一株高产乙酸乙酯的异常汉逊氏酵母菌株，乙酸乙酯是小曲酒中的主要酯类和主体香味成分，其含量直接影响了小曲酒的优酒率。本研究首先拟利用在大肠杆菌和酵母菌的穿梭载体构建异常汉逊氏酵母基因组文库，将转座子标签随机插入异常汉逊氏酵母的染色体库中建立转座标签库，然后将此异常汉逊氏酵母染色体转座标签库酶切后转化异常汉逊氏酵母氨基酸缺陷型受体菌株,使其与完整的受体酵母染色体发生同源重组，在特定的条件下培养,通过现代色谱分析技术对比分析它们的发酵产物，选出与产乙酸乙酯性状相关的重组子, 即得到转座标签插入突变体库，分析转座子标签插入位点的相邻区域，即可确定转座子在基因组上的插入位点。筛选出异常汉逊氏酵母乙酸乙酯代谢关键基因，从而分析出异常汉逊氏酵母代谢产生乙酸乙酯的分子机制，并进一步分析其主要代谢途径，找到其调控方法，促进小曲酒的发展。

乙酸乙酯是小曲酒中的主要酯类和主体香味成分，其含量直接影响了小曲酒的优酒率。本研究首先拟利用在大肠杆菌和酵母菌的穿梭载体构建异常汉逊氏酵母基因组文库和CDNA文库，筛选出异常汉逊氏酵母乙酸乙酯代谢关键基因，从而分析出异常汉逊氏酵母代谢产生乙酸乙酯的分子机制，并进一步分析其主要代谢途径，找到其调控方法，促进小曲酒的发展。. 从清香型小曲白酒酿酒用曲中分离纯化出十几株菌株，将这些株菌进行产酯能力的试验，最后得到1株高产乙酸乙酯的菌株，其产乙酸乙酯和总酯能力分别为2.152g/L和2.368g/L。通过分子生物学鉴定，该酵母为异常汉逊式酵母。将该菌株强化到小曲酒的发酵中，通过现代色谱分析技术对比分析发酵产物，结果乙酸乙酯的含量提高了49.8%。. 将从小曲中选育出的高产乙酸乙酯的异常汉逊氏酵母菌株基因组用BamH I单酶切，酶切片段与磷酸化后的pPIC9质粒连接，转化到CaCl2法制备的E.coli TGI感受态细胞，涂布抗性平板，筛选转化子。BamHI单酶切的片段主要集中在8.0 kb以上。抗性平板上生长的转化子总数目超过1.38×102pfu，达到建库的要求。. 研究构建了异常汉逊氏酵母CDNA文库，CDNA文库平均插入片段长度：1kb以上，全长率：74.07%，空载率：0%，冗余度：42.53%，滴度：1.0×106cfu/ml， 库容：3*106以上。. 本研究构建了酵母基因组文库及CDNA文库，为研究产酯酵母的产香分子机理奠定一定基础。