基于亚细胞蛋白质组学技术的高山被孢霉老化中脂滴的调控机制研究

Unknown molecular mechanism has hampered the further research and development of microbial oil. Lipid droplet is a major place for microbe to store oil, but how lipid droplet involved in lipid metabolism remains elusive. As a fast-growing direction of proteomics technologies, subcellular proteomics technology can explore the constitution and function of the proteins in a specific cellular substructure from subcellular level. Since the ageing of Mortierella alpina can affect the synthesis of Arachidonic acid (AA or ARA), this project will use traditional whole-cell proteomics technology to obtain the whole cell protein expression data, and then using subcellular proteomics technology to investigate the protein expression change of lipid droplet during the ageing process of Mortierella alpina. Subsequently, unravel the categories and functions of the proteins in lipid droplet by bioinformatics tools and molecular biology technologies. Then the mechanism of how lipid droplet participates in the lipid synthesis during Mortierella alpina ageing process and the important regulatory proteins will be figured out. Finally, based on the function and characteristics of the obtained molecular mechanisms and key proteins, we will design and develop a new ageing technology to further improve the content of ARA in the total oil of Mortierella alpina.

分子机制模糊极大制约了微生物油脂的深入研究与开发。脂滴是产油微生物储存油脂的主要场所，但其在油脂合成代谢中的调控机制尚未完全阐明。作为蛋白质组学技术中快速发展的一个方向，亚细胞蛋白质组学技术能在亚细胞水平深入探究细胞内特定亚结构中蛋白质的组成及功能。本项目拟以高山被孢霉老化（ageing）影响花生四烯酸（ARA）油脂合成这一现象为切入点，在运用传统的全细胞蛋白质组学技术分析胞内整体蛋白质表达的基础上，进一步采用亚细胞蛋白质组学技术深入分析老化过程中脂滴表面蛋白质表达的变化，结合生物信息学方法和分子生物学技术，探明脂滴表面蛋白质的种类及其在老化过程中的功能，从蛋白质层次明晰高山被孢霉老化过程中脂滴参与调控ARA油脂合成的途径和关键蛋白质，依据所得分子机制和关键蛋白质的功能及特性，有目的性地设计和发展一种新颖、高效的老化技术（ageing technology），实现总油脂中ARA含量的提高。

花生四烯酸（ARA）是一种具有重要生理功能的不饱和脂肪酸，利用高山被孢霉老化发酵生产ARA的经济价值显著。本项目应用蛋白质组学技术对高山被孢霉老化机制进行系统探究，主要完成3方面工作：1）发现在老化中有171个蛋白显著差异表达，积累的活性氧（ROS）激活苹果酸/丙酮酸循环，产生NADPH消除ROS，减少细胞损伤，另一部分NADPH为合成ARA提供还原力；老化中NADP+—异柠檬酸脱氢酶活性上调2.7倍，而苹果酸酶活性降低，推测NADPH主要由NADP+—异柠檬酸脱氢酶提供；2）采用亚细胞蛋白质组学技术分析ARA“仓库”-脂滴的蛋白组成及功能变化，发现62种蛋白在老化中差异表达。其中果糖代谢相关蛋白上调使得丙酮酸积累，丙酮酸可进入苹果酸/丙酮酸循环合成NADPH及ARA；3）在老化阶段，添加1.6 g/L硝酸钾（KNO3）和尿素（Urea），发现KNO3可显著提高ARA的合成，而Urea抑制。蛋白质组学结果显示添加KNO3能激活胞内碳水化合物代谢、氨基酸代谢途径，为细胞提供更多的底物和能量。磷酸戊糖途径和NADP+—异柠檬酸脱氢酶为ARA的合成提供更多NADPH。而添加Urea对细胞造成损伤，磷酸戊糖途径和苹果酸合酶的下调使得NADPH供给减少，抑制ARA的合成。以上结果有助于高山被孢霉老化技术的深入开发，也为研究其它微生物油脂的生产提供参考和指导。