新烟碱类杀虫剂对中华蜜蜂化学通讯信息识别系统功能影响机理

Bee's chemical communication system is closely related to social behavior such as pollination, courtship and so on. In recent years, it was found that the sublethal doses of neonicotinoid insecticides residues in plants could affect the physiological function of bees. In order to further analyze the mechanism of the effects of neonicotinoid insecticides residues on the chemical communication behavior and function of the native bee - Apis cerana cerana, the project will be carried out from the following: ① First of all from the investigation of the behavioral and physiological effects of insecticide on bees’ chemical communication; ② To identify the chemical communication related genes (such as OBPs and CSPs) based on their changing of expression profiles responding the insecticide stress using transcriptome sequencing method; ③ qRT-PCR was used to verify the expression profiles of chemical communication related genes (such as OBPs and CSPs) in the various parts of body after treatment with insecticides; ④ The prokaryotic expression and protein purification of related OBPs and CSPs were carried out, and the molecular interactions, key amino acid sites and the effects of insecticide on the chemical recognition function of OBPs and CSPs were investigated in vitro. The results will provide a theoretical basis for the influence of neonicotinoid insecticides on the chemical communication behavior of non-target insects, and provide theoretical reference for the sustainable utilization and development of agricultural pollination resources in China.

蜜蜂的化学通讯系统与其访花传粉、求偶等社会性行为密切相关，而近年来发现新烟碱类杀虫剂在植物中的亚致死剂量残留会对蜜蜂生理功能造成影响。为了深入解析这种残留对我国本土蜜蜂——中华蜜蜂Apis cerana cerana化学通讯行为和功能影响机理，本项目拟从以下开展：①从行为学和生理学角度研究杀虫剂处理后对中蜂化学通讯行为的影响；②转录组测序鉴定对杀虫剂胁迫响应显著的化学通讯信息识别相关基因（如OBPs与CSPs）的表达变化；③qRT-PCR分别验证OBPs和CSPs在中蜂经杀虫剂处理后的各部位表达谱；④对相关OBPs和CSPs进行原核表达和蛋白纯化，并体外考察杀虫剂与中蜂OBPs和CSPs重组蛋白的分子相互作用、关键位点以及杀虫剂对它们化学通讯识别功能的影响。研究结果将为新烟碱类杀虫剂对非靶标昆虫的化学通讯行为影响提供理论依据，为我国农业授粉资源的可持续利用和发展提供理论参考。

蜜蜂的化学通讯系统与其访花传粉、求偶等社会性行为密切相关，而近年来发现新烟碱类杀虫剂在植物中的亚致死剂量残留会对蜜蜂生理功能造成影响。为了深入解析这种残留对我国本土蜜蜂——中华蜜蜂Apis cerana cerana化学通讯行为和功能影响机理。本项目利用转录组学技术发现亚致死剂量吡虫啉对中蜂对神经信号转导、代谢通路、电子传递链产生不同程度上调，对P450家族的基因表达产生下调影响，能引起超氧化物歧化酶家族的SOD2和气味结合蛋白基因OBP17显著的上调表达。研究了中蜂化学通讯系统中气味结合蛋白OBP2、OBP11、OBP17和化学感受蛋白CSP1等的生理功能，发现其均能与花香类物质β-紫罗兰酮、蜂王信息素成分HOB能产生较强的结合，通过热动力学、分子对接和定点突变鉴定了部分蛋白与高亲和力配基结合的关键氨基酸位点，如Ser123和Lys51（OBP2），Ile97和Ile140（OBP11），和Phe44（CSP1）等。另外发现OBP1、OBP11、OBP12、OBP17、CSP3均能与吡虫啉有较强的亲和力，鉴定出部分蛋白与吡虫啉结合的关键氨基酸位点，如Phe88（OBP12），Arg66和Ser6+Tyr7（CSP3），其中Arg66在CSP3与吡虫啉作用过程中贡献了氢键。另外发现在较高的浓度下吡虫啉能促进OBP11与HOB的亲和力。利用RNAi技术对OBP1、OBP17和CSP3进行体内功能的研究，在注射dsRNA 24h后，三者相对表达量相较于对照组均呈极显著下降（p<0.01）。测定注射OBP17 dsRNA 24h后工蜂前足对吡虫啉和β-紫罗兰酮的EAG反应，结果显示随着刺激物浓度升高EAG反应强度均而增强，表明OBP17基因沉默的中蜂前足对吡虫啉和β-紫罗兰酮的刺激更为敏感，结合吡虫啉处理会显著上调OBP17的表达，表明OBP17蛋白可能起到中蜂吡虫啉解毒和机体保护的作用。本研究证实通常情况下新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的化学感受功能能够受到抑制，然而也发现吡虫啉在较高浓度下反而能促进嗅觉蛋白与配基的亲和力，且下调表达个别OBPs中蜂反而对吡虫啉更加敏感。这也表明新烟碱类杀虫剂吡虫啉对中蜂化学感受功能影响的多样性，丰富了不同剂量新烟碱类杀虫剂对昆虫化学感受机理的研究知识，为我国农业授粉资源的可持续利用和发展提供理论参考。