调控RB信号通路激活耳蜗毛细胞再生

耳蜗毛细胞损伤后不具有自发再生能力，一旦损伤将造成永久性听力障碍，激活毛细胞再生是理想的治疗感音神经性耳聋途径。RB基因是控制内耳前体细胞处于静止状态和毛细胞存活的关键基因，完全敲除RB基因，可以激活毛细胞再生，但再生的毛细胞迅速发生凋亡。理想的方法是短暂下调RB基因激活耳蜗毛细胞再生，并维持RB在新生毛细胞中表达以维持其存活，修复损伤的耳蜗感觉上皮，达到听觉功能修复。已知raf-1基因与RB基因结合可以抑制pRB功能，过量表达raf-1可以促进pRB磷酸化，促进细胞进入细胞周期。我们预实验结果显示，raf-1在内耳前体细胞增殖期高度表达，毛细胞发育成熟后表达下降，本项目拟以腺病毒为载体，在受损伤的耳蜗感觉上皮过量表达raf-1基因，试图通过raf-1过量表达抑制pRB功能，激活静止期的支持细胞重新进入细胞周期，增殖并分化为新生的毛细胞，为基因治疗感音神经性耳聋奠定实验基础。

耳蜗毛细胞损伤后不具有自发再生能力，一旦损伤将造成永久性听力障碍，激活毛细胞再生是理想的治疗感音神经性耳聋途径。RB基因是控制内耳前体细胞处于静止状态和毛细胞存活的关键基因，完全敲除RB基因，可以激活毛细胞再生，但再生的毛细胞迅速发生凋亡。理想的方法是短暂下调RB基因激活耳蜗毛细胞再生，并维持RB在新生毛细胞中表达以维持其存活，修复损伤的耳蜗感觉上皮，达到听觉功能修复。已知raf-1基因与RB基因结合可以抑制pRB功能，过量表达raf-1可以促进pRB磷酸化，促进细胞进入细胞周期。我们的实验结果显示，raf-1在内耳前体细胞增殖期高度表达，毛细胞发育成熟后表达下降。我们首先采用化学阻断剂RRD-251和U0126调控pRB磷酸化状态，利用斑马鱼、鸡胚等模型观察了pRB磷酸化状态对毛细胞再生、细胞增殖和细胞凋亡的影响，结果提示抑制Rb-Raf-1信号通路降低pRB磷酸化状态，导致斑马鱼细胞增殖和毛细胞再生降低；此外Rb-Raf-1信号通路也参与调节鸡胚内耳前体细胞增殖和凋亡。我们在哺乳动物小鼠体内进一步研究发现，Shh可以下调Rb基因表达，同时使pRB蛋白表达显著降低，同时激活细胞周期因子，揭示了Shh通过调控Rb基因从而激活毛细胞再生的理论。 同时建立了良好的成年鼠耳蜗培养体系及病毒转染模型，使体外成年鼠毛细胞再生药物的筛查及基因干预成为可能。本项目共计发表标注本项目资助的论文9篇，圆满完成了任务。