植物周质微管中微管切割蛋白Katanin互作网络调控机制的研究

Plant cortical microtubules play pivotal roles in plant cell morphogenesis. Microtubule arrays are highly dynamic in response to varied environmental cues and developmental stimuli during cell morphogenesis. Microtubule severing plays a central role in the dynamic remodeling of microtubule arrays. Katanin, is the only microtubule severing enzyme, which has been confirmed in plants. Previously, we uncovered that the Arabidopsis Katanin complex is composed of a hexamer of KTN1-KTN80 heterodimers; KTN80 confers precision to microtubule severing by specific targeting of Katanin complexes; the katanin p60 subunit KTN1 is required for oligomerization in forming functional KTN80-KTN1 complexes that catalyze severing. However, microtubule severing is a complicated process. It remains elusive whether other adaptor proteins contribute to the precise targeting of the Katanin complex and consequent microtubule severing. In this study, we will investigate the interaction-network associated with Katanin-mediated microtubule severing in Arabidopsis epidermal cortical microtubule model system, using methods of immunoprecipitation and ultrahigh resolution mass spectrometer, bioinformatics, genome editing technique CRISPR/Cas9 , live cell imaging and etc. The expected outcome will clarify the Katanin regulatory network in the microtubule severing, and identify key adaptor proteins which contribute to specific targeting of katanin complexes and precise severing, and provide further insight into microtubule dynamic remodeling and cell morphogenesis.

微管是细胞骨架的重要组成部分，具有高度的动态特征，以及时响应多变的环境和生长信号，调控细胞形态建成。微管切割，在微管的动态重构中发挥中心枢纽作用。Katanin是迄今植物中唯一功能得到证实的微管切割酶复合体。我们在拟南芥中的研究揭示：Kantain复合体是由异源二聚体KTN1-KTN80六聚化后形成的多聚体；KTN80通过将Katanin精确制导向微管成核位点和交叉点而决定微管切割的特异性。但目前尚不清楚是否有其它Adaptor蛋白参与Katanin的精准切割。本研究将以拟南芥周质微管为模型，运用免疫共沉淀、高分辨率质谱鉴定、生物信息学、CRISPR/Cas9基因组编辑和活细胞显微成像等技术，探究微管切割蛋白Katanin互作网络调控模式。预期结果将阐明Katanin的调控网络，鉴定参与Katanin复合体精准切割的Adaptor蛋白，为人们深入了解微管动态重构和细胞形态建成提供理论基础。

微管切割蛋白Katanin是植物微管动态重组的核心蛋白。通过Katanin介导的微管切割，周质微管阵列可以不断进行活跃的重构，以响应植物激素信号，从而调控植物细胞生长及极性。本研究按照计划，深入研究了微管切割蛋白Katanin的调控网络。我们首先通过Maxquant非标定量的方法，我们富集到了与katanin互作的蛋白，并发现部分基因参与雄蕊花丝伸长发育过程。随后我们聚焦于花丝发育的过程，并发现微管切割缺陷突变体lue1和ktn80.1234表现出特异的花丝伸长受限表型，使得花药不能到达柱头，不能顺利完成授粉。冷冻扫描电镜和树脂切片发现lue1和ktn80.1234的雄蕊花丝细胞极性伸长存在缺陷。活细胞成像检测结果发现ktn80.1234花丝细胞中的微管阵列排列紊乱无规则，无法招募KTN1到微管切割位点来行使微管切割功能。另一方面，我们发现BR信号通路中核心转录因子突变体qui-2的雄蕊花丝也无法使花药达到柱头，且雄蕊花丝细胞伸长存在缺陷。同时KTN1和4个KTN80在qui-2中的表达量显著下降，说明KTN1和4个KTN80可能受BR信号通路核心转录因子正向调控。随后通过ChIP-qPCR、凝胶阻滞实验和LUC荧光素实验，我们验证了BZR1和BES1可以直接结合到KTN80.4的启动子上，来正向调控katanin复合体的表达。进一步，活体细胞成像显示qui-2中微管阵列排列紊乱无规则且微管的切割频率相对野生型显著下降。这些研究结果揭示了BR信号通路整合katanin复合体介导的微管切割，控制雄蕊花丝快速伸长、成功完成授粉的分子细胞机制。为系统解析katanin的分子互作调控网络提供了重要支持，并为研究植物细胞形态建中的细胞调控机制提供了重要理论依据。