DNA甲基化在先天性小耳畸形发病机制中的作用研究

先天性小耳畸形的发病机制尚不明确，环境和遗传均是其重要发病因素。表观遗传学的研究进展为先天性小耳畸形发病机制研究提供了新的思路，DNA 甲基化是最常见的一种表观遗传学机制。经初步实验发现先天性小耳畸形患者EYA1基因启动子区域CpG岛存在低甲基化改变。先天性小耳畸形患侧表现为颌面部发育不良，与肿瘤组织的过度增生相反，因而提出"先天性小耳畸形存在整个基因组高甲基化和局部基因低甲基化"的假说。本课题通过全基因组水平筛选先天性小耳畸形特异性CpG 岛甲基化谱型改变，对候选基因启动子区域甲基化改变行定量分析，确定甲基化异常的关键CpG 位点。通过影响甲基化的药物干预，进一步研究EYA1及其他候选基因CpG岛甲基化改变对相应基因表达及耳软骨细胞生物学特性的影响。探讨DNA甲基化异常与先天性小耳畸形的发病关系，为其发病机制提供新的科学理论。

目的: 筛查先天性小耳畸形全基因组甲基化水平异常的CpG岛和CpG位点及其相关差异基因，研究差异基因CpG岛的甲基化水平和基因表达的关系，检测去甲基化药物干预后差异基因表达水平的改变，探讨基因甲基化水平的异常与小耳畸形发病之间的关系。方法：收集小耳畸形患者残耳软骨组织为实验组，非耳畸形患者的正常耳软骨组织为对照。选用Nimblegen CpG启动子芯片对实验组、对照组行全基因组CpG岛扫描，筛选差异基因。选用SpectroCHIP芯片对实验组47例，对照组31例的差异基因的CpG岛进行各个CpG位点的检测，筛选存在甲基化水平差异的CpG位点。在体外分离、培养残耳及正常耳软骨细胞，选取部分对照组第3代细胞作为对照2组，加入5氮杂胞苷干预，运用实时荧光定量PCR对实验组及对照组的组织及细胞进行差异基因RNA表达水平检测并行统计学分析。结果：1.实验组与对照组在全基因组范围内存在36个具有甲基化水平差异的CpG岛，其中29个与已命名的29个基因相关。2.实验组与对照组在 COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3这四个差异基因的CpG岛内有6个CpG位点的甲基化水平存在差异且具有统计学意义。3.细胞增殖及毒性实验证实5氮杂胞苷对正常耳软骨细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用。4.在软骨组织中，COL18A1基因的RNA表达水平在实验组较对照组低，MYH14、RBMY1A1这2个基因的RNA表达水平在实验组均较对照组高，且具有显著性差异。在软骨细胞中，COL18A1，MYH14，ZIC3这3个基因的RNA表达水平在实验组均较对照组高，但不具有显著性差异；对照组与对照2组在COL18A1，MYH14、ZIC3这3个基因的RNA表达水平在对照2组均较对照组高，且具有显著性差异。结论：本研究初步建立了先天性小耳畸形的甲基化谱，在全基因组DNA甲基化水平上有36个CpG岛存在差异，检测COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3基因共有6个CpG位点具有甲基化水平差异。5氮杂胞苷干预实验证实差异基因的表达水平与DNA甲基化相关；MYH14、RBMY1A1这2个差异基因在实验组和对照组的表达差异符合CpG岛甲基化水平的差异，表明在先天性小耳畸形中MYH14和RBMY1A1的表达调控与DNA的甲基化水平密切相关；推断小耳畸形的发病可能与DNA的甲基化水平存在密切的关系。