沙蟾毒精空间异构体抑制小鼠肝癌淋巴道转移机制研究

目前尚无明确淋巴道转移抑制药物。前期，申请人采用正交二维分离法于蟾蜍中首次发现沙蟾毒精空间异构体(简称药物)，初步研究能够抑制淋巴道转移。本次，以自建的同源、特异性淋巴道转移小鼠肝癌Hca-F（高转移，VEGF-C高表达）及Hca-P（低转移，VEGF-C低表达）细胞为实验对象，体内验证药物对淋巴结转移率-肿瘤组织VEGF-C、VEGFR-3表达-淋巴管密度影响；对淋巴管生成动物模型淋巴管生成及VEGF-C、VEGFR-3表达影响。体外以肿瘤与小鼠淋巴管内皮细胞共培养系统为研究对象，观察药物对共培养2细胞增殖、迁移、侵袭、黏附、微管形成及相关分子影响，探讨它们与VEGF-C、VEGFR-3表达关联，关注药物对淋巴管生成 VEGF-C/VEGFR-3通路VEGF-C、VEGFR-3、ERK1/2、 Akt、CREB表达及磷酸化影响，解析药效机制。为研发具有自主知识产权淋巴道转移药物奠定基础。

作为恶性肿瘤早期转移的主要形式，淋巴道转移的有效干预是肿瘤转移治疗的重要策略。目前尚无明确的肿瘤淋巴道转移抑制药物。华蟾素注射液（蟾蜍制剂）是中国原研抗肿瘤中药制剂，能够抑制肿瘤淋巴道转移，其高效、低毒的抗肿瘤作用正在受到西方医学的关注，目前已于美国权威肿瘤机构MD.Anderson进行II期临床试验，临床评价良好。.项目首次证明华蟾素注射液中含有沙蟾毒精空间异构体（前期，申请人采用正交二维分离法于蟾蜍中首次发现的沙蟾毒精空间异构体）。研究以沙蟾毒精空间异构体、华蟾素注射液及蟾毒灵（华蟾素注射液含量最高的有效成分）为研究对象，以人的四种肝癌细胞系（HepG-2、SMMC-7721、BEL7402和MHCC-97H）、小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移株（HCa-F）、人淋巴管内皮细胞（HLEC）和鼠淋巴管内皮细胞（MLEC）为研究对象，建立了人及鼠肝癌细胞与其淋巴管内皮细胞的共培养系统以及肿瘤诱导的特异性淋巴道转移动物模型。通过特异性肿瘤淋巴道转移模型及肿瘤细胞与其淋巴管内皮细胞的共培养系统，验证了VEGF-C/VEGFR-3 信号转导通路与肿瘤淋巴道转移及肿瘤淋巴管生成的关联，确立了调控关系；验证了药物对肿瘤淋巴道转移－肿瘤淋巴管生成－VEGF-C/VEGFR-3 信号转导通路的抑制作用，验证了药物对肿瘤淋巴道转移－肿瘤淋巴管生成抑制作用与VEGF-C/VEGFR-3 信号转导通路的关联，验证了药物对肿瘤细胞及其共同作用的淋巴管内皮细胞淋巴道转移相关生物学行为的影响（增殖、粘附、迁移、侵袭及微管形成等淋巴道转移恶性行为及其相关分子 PCNA、 Ki-67； HGF、 CXCR4； MMP2、 MMP9； 整合素α4、钙粘蛋白；VEGFR-3 表达及磷酸化）与VEGF-C/VEGFR-3信号转导通路的关联，揭示了VEGF-C/VEGFR-3 信号转导通路为沙蟾毒精空间异构体、华蟾素注射液及蟾毒灵抑制肿瘤淋巴道转移及肿瘤淋巴管生成的分子机制。目前尚无明确的淋巴道转移抑制药物，项目的展开，1，为淋巴道转移抑制药物的研发奠定基础。2，进行复合组分（华蟾素注射液）与单一化合物（沙蟾毒精空间异构体、蟾毒灵）疗效比对分析，科学阐释组分药物优势。3，为具有中国知识产权的药物华蟾素注射液立足国际市场奠定基础，为世界贡献机制明晰的抗肿瘤中药。