PhoP/PhoR双组份系统调控鸭疫里氏杆菌毒力的机制研究

Two component systems (TCSs) play important roles in the regulation of bacterial virulence. RAYM_RS09735/RAYM_RS09740 was confirmed as a PhoP/PhoR TCS in Riemerella anatipestifer by bioinformatics and RNA_Seq analysis in our previous studies, and PhoP/PhoR is first reported in gram-negative bacteria. The RAYM_RS09735/RAYM_RS09740 gene deletion strain lost the pathogenicity in ducklings, but its mechanism of regulation in virulence is not clear. In this study, we will perform In vitro phosphorylation assays to detect the autophosphorylation and phosphotransfer of PhoR and PhoP, and comfirm the sites of phosphorylation. To exploit the virulence genes which regulated by this TCS by constructing phoR or phoP deletion strain respectively. To investigate the target gene DNA motif and obtain the directly regulated virulence genes by PhoP with over expression of PhoP and using ChIP-Seq, bioinformatics and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Associated virulence gene deletion strains will be constructed to determine the virulence. Our study is aim to clarify the mechanism of regulation of virulence factors expression by this TCS, it will lay the foundation for revealing the molecular pathogenic mechanism of R. anatipestifer, and provide the theoretical basis for discovery of novel virulence factors，novel drug targets, diagnostic markers and vaccine candidate antigens.

双组份系统对细菌毒力的调控起着至关重要的作用。我们前期研究发现鸭疫里氏杆菌RAYM_RS09735/RAYM_RS09740是一对PhoP/PhoR双组份系统，该双组份系统为革兰阴性菌中首次报道。该双组份缺失株对雏鸭的毒力显著降低，但其调控毒力的机制不清楚。本研究拟在体外检测PhoR、PhoP的自磷酸化和磷酸基团转移，并确定PhoR、PhoP的磷酸化位点；通过构建该双组份单基因缺失株，挖掘其调控的毒力相关基因；通过PhoP超表达，运用ChIP-Seq、生物信息学和凝胶阻滞电泳实验等技术分析确定PhoP结合的靶基因启动子DNA motif，筛选其直接调控的毒力基因，并进一步构建相应的基因缺失突变株，对其毒力进行验证。阐明该双组份系统调控鸭疫里氏杆菌毒力的机制，为揭示鸭疫里氏杆菌的分子致病机制奠定基础，为新毒力因子、新药靶标、诊断标识和疫苗候选抗原等的发现提供理论依据。

我们前期在鸭疫里氏杆菌RA-YM株中发现了一对新的双组份系统PhoPR，并成功进行了缺失。这是第一个在革兰氏阴性菌中发现的PhoPR双组份系统，ΔphoPR双基因缺失株完全丧失了对雏鸭的致病性，但是PhoPR调控下游基因表达的机制尚不清楚，同时我们发现ΔphoPR对雏鸭的免疫保护效果不佳。在本项目中，我们首先分别构建了phoP、phoR的单基因缺失株，动物实验结果表明其对雏鸭的致病性均显著降低。接着我们通过RNA-seq和DAP-seq技术获得了PhoP在RA-YM基因组上的结合位点，分析得到了PhoP的DNA结合序列，筛选到50个PhoP直接调控基因，并且发现PhoP的体外DNA结合能力不受磷酸化影响。同时ΔphoP、ΔphoR两个基因缺失株通过皮下注射免疫雏鸭，对RA-YM的攻毒均具有良好的免疫保护作用。进一步对PhoP直接调控基因的进行分析发现了一个Bat操纵子，并发现鸭疫里氏杆菌可以通过PhoP对Bat操纵子进行调控，从而对H2O2氧化应激进行响应。此外在鸭疫里氏杆菌中发现了一个50K基因岛和10K基因岛，分别对这两个基因岛的整合酶功能进行了研究，并且基于10K基因岛整合酶功能开发了一个新的鸭疫里氏杆菌表达外源基因的方法，应用该方法构建了表达eGFP的重组RA-YM菌株。通过本项目的研究，成功构建了9个基因缺失株，其中ΔphoP、ΔphoR、Δcas9、ΔNLP/P60、ΔbatA、KYF39_09285等6个基因缺失株与亲本株相比，其对雏鸭的毒力均明显减弱。本研究全面解析了PhoP在RA-YM基因组上的直接结合能力，阐明了PhoPR双组份调控鸭疫里氏杆菌毒力的机制，并获得了ΔphoP、ΔphoR、Δcas9等3个免疫原性良好的基因缺失弱毒活疫苗候选菌株，为深入研究鸭疫里氏杆菌的致病分子机制和基因工程活疫苗的研发奠定了良好的基础。