Crif1调控辐射应激CDK2核转位与活性的机制研究

After radiation stress, cell G1 phase arrest can promote DNA damage repair. CDK2 is the key regulation factor of cell G1/S checkpoint, and its active state is closely related to the subcellular localization, but the regulatory mechanism of its nuclear transfer has not been fully elucidated. Our previous research found that Crif1 have direct interaction with CDK2. After radiation stress, Crif1 and CDK2 both gathered in nuclei and induced cell G1 phase arrest, while interference expression of Crif1, CDK2 nuclear transfer was inhibited, and cell apoptosis increased significantly. Based on the above, we speculate that Crif1 regulate the activity of CDK2 by mediating its nuclear transfer, block cells in G1/S checkpoint and participate in radiation stress. In this project, RT-PCR, WB, immunofluorescence and flow cytometry are used to detect CDK2 subcellular localization, cell cycle, DNA repair and cell state changes after radiation stress, when expression levels of Crif1 and CyclinE are intervened. Ultraviolet round two chromatography and Hydrogen deuterium exchange of mass spectrometry are used to detect conformational changes of Crif1 interacting with CDK2 in vitro. To confirm the combination of sequences of Crif1 interacting with CDK2, truncated mutants and point mutations are also used. On this basis to explore mechanism of Crif1 radiation biological effect.

辐射应激后，细胞G1期阻滞可促进DNA损伤修复，CDK2是细胞G1/S检查点关键调控因子，其活性状态与亚细胞定位密切相关，但CDK2核转位调控机制尚未完全阐明。我们前期研究发现，Crif1与CDK2有直接相互作用；辐射应激后，Crif1与CDK2核内共聚集并诱导细胞G1期阻滞，而抑制Crif1表达后CDK2核转位受阻，细胞凋亡显著增加。据此我们推测，Crif1通过介导CDK2核转位并调控其活性继而诱导细胞G1期阻滞，参与细胞辐射应激。本项目拟通过RT-PCR、WB、免疫荧光及流式细胞技术等方法研究干预Crif1、CyclinE表达水平后，辐射应激下CDK2亚细胞定位、细胞周期、DNA修复及细胞状态变化；然后通过远紫外圆二色谱和氢氘交换技术研究Crif1与CDK2体外相互作用的结合力和构象变化；通过构建截短突变体并经点突变验证明确二者结合序列；旨在探索Crif1参与细胞辐射应激的作用机制。

随着核技术的广泛应用及深空探索的深入，放射防护技术的研究日益迫切，但机体放射应激的分子机制远未明晰。课题组前期研究发现，放射后CRIF1表达水平升高对细胞存活具有重要意义。为阐明CRIF1在细胞放射应激中的作用机制，我们开展了以下研究：CRIF1在骨肉瘤中表达水平及其临床意义，放射后CRIF1对CDK2的活性调控机制及其在细胞存活中的作用，明确CRIF1与CDK2的相互作用的关键位点，筛选CRIF1与CDK2作用的界面抑制剂，探索抑制剂对细胞放射应激反应的影响，以及CRIF1对NRF2的调控方式及效应。本研究取得了以下重要结果：临床研究发现，骨肉瘤肿瘤组织高表达CRIF1，其表达水平与患者生存率呈负相关；CRIF1的高表达促进骨肉瘤细胞的放射抵抗，其作用机制与CDK2相互作用、调控CDK2的空间分布以及磷酸化水平相关；CRIF1与CDK2的相互作用可通过磷酸化CDK2 Thr160位点直接促进DNA损伤修复的效率，还可磷酸化CDK2 Thr14位点参与G1检查点的激活为DNA损伤修复提供时间；明确了CRIF1与CDK2作用的关键位点在CDK2的Arg200，Arg214和Asp210以及CRIF1的His120，Glu116和Gln112上，筛选得到CRIF1与CDK2作用的界面抑制剂，证实这些抑制剂能增加肿瘤细胞的放射敏感性，并明确其机制是通过抑制CRIF1与CDK2作用实现。另外，我们还发现放射后CRIF1表达升高并与PKC-δ相互作用后磷酸化NRF2 S40，参与NRF2的入核转运启动II相解毒酶的转录表达。我们在该项目资助下证实：放射后CRIF1表达上升可通过DNA损伤应答和氧化应激途径促进细胞存活，明确了CRIF1与CDK2作用的关键氨基酸残基，获得可以特异抑制CRIF1与CDK2结合的抑制剂并证明其具有肿瘤细胞放射增敏作用。因此，我们的研究初步阐明了CRIF1在细胞放射应激中的分子机制，对靶向CDKs的抑制剂的筛选具有指导意义和应用价值。