番茄果实成熟相关长链非编码RNA转录生成的分子调控机制

Due to serious loss of fruits at home and abroad each year, it has important theoretical and practical significance to launch the research on the mechanism of fruit ripening and senescence. Tomato is a classic model plant for the research in fleshy fruit ripening, our previous study showed that long non-conding RNAs (lncRNAs) are involved in the regulation of tomato fruit ripening. We will scan on target lncRNAs of important tomato fruit ripening-related transcription factor RIN at genome-scale level; carry out high-throughput functional screening of key target lncRNAs using virus induced gene silencing; employ CRISPR-Cas9 technology to knock out the locus of key target lncRNAs; and study the relationship of RIN and promoters of key target lncRNAs with dual-luciferase reporter assay in vivo. Overall, these results will elucidate the transcriptional regulation mechanism of tomato fruit ripening-related lncRNAs by RIN. In short, Our work will try to investigate and explore fruit ripening from another point of view of lncRNA, which will provide new biological resource and new way for regulation on fruit ripening.

针对每年国内外果品采后损失严重的实际问题，开展果实成熟衰老机制的研究具有重要的理论和实际意义。番茄是研究果实成熟的经典模式植物，课题组前期研究表明一些长链非编码RNA参与番茄果实成熟调控。本项目将在整个番茄基因组水平挖掘重要的番茄果实成熟相关转录因子RIN的靶lncRNA；利用病毒诱导基因沉默技术高通量筛选与果实成熟相关的关键靶lncRNA；通过CRISPR-Cas9等技术敲除靶lncRNA位点，解析关键靶lncRNA在番茄果实成熟中的生物功能；利用双荧光素酶报告基因检测系统探明RIN与关键靶lncRNA启动子的相互作用关系，最终准确而清晰的诠释RIN介导的番茄果实成熟相关lncRNA转录生成调控的分子机制。从新的角度审视和探究番茄果实成熟的调控机理，为果实成熟调控提供新的功能分子元件，为改造番茄果实性状提供新的途径。

果实的成熟涉及种子的形成以确保繁衍后代，以及果实品质包括色泽、风味以及营养物质的形成，然而果品的采后损耗直接影响到果实品质和采后保鲜。因此，研究果实成熟的分子调控机制对采后果实的品质保持有着重要的科学和社会意义。本项目以番茄为研究对象，应用染色质免疫共沉淀高通量测序（ChIP-Seq）结合转录组分析等手段，挖掘在全基因组水平下转录因子RIN直接调控的靶lncRNA，研究了靶lncRNA对番茄果实成熟的影响，探讨了RIN介导果实成熟相关靶lncRNA生成的转录调控机制，为揭示番茄果实成熟的调控机制提供新的重要线索，最终为果实品质保持和耐贮性改良提供理论基础。. 结果表明：（1）采用ChIP-Seq研究综合番茄果实lncRNA表达谱数据挖掘转录因子RIN直接调控的靶lncRNA。相比于野生型番茄，其中受RIN调控且在突变体rin中表达下调的lncRNA共有75个，在rin中表达上调的lncRNA共有112个；而在AC::RIN RNAi 突变体果实中表达下调的靶lncRNA共有56个，在AC::RIN RNAi 突变体果实中表达上调的靶lncRNA共有78个。（2）凝胶阻滞（EMSA）体外验证RIN对部分靶lncRNA启动子的结合。（3）染色质免疫共沉淀（ChIP)体内验证RIN对部分靶lncRNA启动子的结合。（4）选择一个靶lncRNA2155，采用TRV介导的病毒诱导基因沉默技术（VIGS）对番茄果实中的基因进行沉默，通过观察植物表型和分子水平的变化，研究靶lnc RNA对番茄果实成熟的影响。（5）研究靶lncRNA2155在不同组织、器官及果实不同成熟时期中的时空表达模式。（6）利用CRISPR-Cas9敲除技术，研究将靶lncRNA21 55位点缺失后，突变体番茄植株会延迟果实成熟，从而表明转录因子RIN的靶lncRNA对番茄果实成熟的调控作用。