番茄果实成熟相关RNA结合蛋白的调控机制研究

Due to serious loss of fruits at home and abroad each year, it is important theoretical and practical significance to launch the research on the mechanism of fruit ripening and senescence. Tomato is an important horticultural crops and a model plant for the research in fleshy fruit ripening.Our previous study shows that microRNA and lncRNA is related to tomato fruit ripening. This project aims to carry out in-depth research on RNA binding protein by genome-wide discovering RNA binding proteins in tomato and illustrating their biological function. Then we use RNA-seq and RIP-seq technology to identified target RNA of RNA binding protein to clarify the molecular mechanism of RNA binding protein regulation on fruit ripening,which will provide new gene resource and new way for fruit ripening regulation.

针对每年国内外果品采后损失严重的实际问题，开展果实成熟衰老机制研究具有重要的理论和实际意义。番茄是重要的园艺作物和研究果实成熟的模式植物，课题组前期研究表明了microRNA和lncRNA都参与了调控番茄果实成熟。本项目拟对RNA结合蛋白开展深入研究，将在全基因组水平筛选与番茄成熟相关的RNA结合蛋白，解析关键RNA结合蛋白的生物学功能，通过转录组测序和RIP-seq技术鉴定RNA结合蛋白直接调控靶RNA，最终准确而清晰的诠释RNA结合蛋白调控果实成熟的分子机制，为果实发育成熟调控提供新的基因资源，为改造番茄果实性状提供新的途径。

果实是开花植物的重要器官，成熟的果实是人类膳食结构的重要的组成。因此了解果实成熟机理，揭示果实成熟调控机制网络，具有重要意义。本项目在全基因组水平筛选与番茄成熟相关的RNA结合蛋白，利用CRISPR/Cas9敲除关键RNA结合蛋白基因，解析关键RNA结合蛋白的生物学功能，通过转录组测序和RIP-seq技术鉴定RNA结合蛋白直接调控靶RNA，最终阐明RNA结合蛋白调控果实成熟的分子机制。主要结果如下：.(1)在番茄基因组中，通过生物信息学手段筛选到43个与番茄成熟相关的RNA结合蛋白基因，再结合基因功能快速鉴定技术VIGS，我们鉴定出3个与果实成熟相关的关键 RBP。对其中的RBP4进行基因进化分析，发现RBP4与拟南芥中的RNA编辑因子ORRM4高度同源，因此将RBP4命名为SlORRM4。对SlORRM4进行表达模式分析发现其在果实中高量表达；对SlORRM4进行亚细胞定位分析，确定其定位于线粒体。.（2）运用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得SlORRM4功能缺失突变体，发现slorrm4突变体的果实成熟进程相比野生型大幅度延迟，并伴随着呼吸峰和乙烯峰的延迟和降低，表明SlORRM4是番茄果实成熟的正调控因子。.（3）RNA-seq分析发现slorrm4突变体中果实成熟和线粒体功能相关的基因表达发生了显著的变化。通过RNA编辑检测和RIP-qPCR试验，表明SlORRM4影响了较多的线粒体RNA编辑效率，并直接与被编辑的靶向RNA结合。观察slorrm4突变体果实的线粒体发现其形态异常，嵴不能正常形成。蛋白免疫杂交发现，slorrm4突变体线粒体呼吸链复合物的关键蛋白表达水平降低，线粒体呼吸链功能受损。这些结果表明SlORRM4调控线粒体RNA编辑影响线粒体功能，进而影响果实成熟过程。.本项目对RNA结合蛋白SlORRM4调控番茄果实成熟分子机理的解析，丰富了果实成熟调控网络，为果实品质保持和耐贮性改良提供理论基础。