PI3Kγ通过PKM2调节Kupffer细胞M2极化在肝移植急性排斥反应中的作用及机制研究

Acute rejection (AR) of liver transplantation seriously affects the prognosis of patients with liver transplantation. Kupffer cells (KCs) play an important role in this process. M2 phenotype KCs can inhibit the AR of liver transplantation in multiple ways, but the mechanism has not yet been well clarified. Our results showed that the AR of liver transplantation and LPS-stimulation caused an increase of expression levels of PI3Kγ and PKM2 in KCs. In addition, over-expression of PI3Kγ in KCs up-regulated the expression of molecular markers of M2 macrophages, regulated the activity of PKM2, a key enzyme of glycolysis，in KCs. Therefore, we proposed a new regulatory mechanism：PI3Kγ can affect the glycolytic process of KCs by regulating the activation state of PKM2, thereby inducing KCs M2 polarization and inhibiting the AR of liver transplantation. In this study, we will observe the influence of the PI3Kγ on the AR of liver transplantation in the established model of rat liver transplantation, explore the molecular mechanism of PI3Kγ in the AR of liver transplantation, and aim to provide a new idea and foundation for inducing KCs M2polarization and inhibiting the AR of liver transplantation.

肝移植急性排斥反应严重影响肝移植患者的预后，Kupffer细胞在肝移植急性排斥反应中发挥重要的作用。M2型Kupffer细胞能通过多种途径抑制急性排斥反应，但其机制尚未完全阐明。前期研究结果显示PI3Kγ及PKM2在发生肝移植急性排斥反应的大鼠Kupffer细胞及体外LPS刺激的Kupffer细胞中表达上调。过表达PI3Kγ能上调Kupffer细胞中M2型巨噬细胞分子标志物表达、调节糖酵解的关键酶PKM2的活化状态。因此我们提出一个新的调控机制：PI3Kγ通过调节PKM2的活化状态以影响Kupffer细胞的糖酵解过程，诱导Kupffer细胞M2极化并抑制肝移植急性排斥反应。本课题利用过表达PI3Kγ的大鼠来建立肝移植急性排斥反应的模型，研究PI3Kγ对急性排斥反应的作用，同时深入研究PI3Kγ负向调控肝移植急性排斥反应的相关分子机制，为诱导Kupffer细胞M2极化、控制肝移植急性排斥反应

研究背景：肝移植是治疗多种晚期肝脏疾病的唯一有效手段，急性排斥反应(Acute Rejection, AR)仍然是导致肝移植失败的重要原因。M2型Kupffer细胞(Kupffer cells，KCs)在抑制肝移植排斥反应及诱导并维持肝移植免疫耐受的过程中发挥重要作用，深入研究KCs极化的内在调节机制有助于控制AR对肝移植预后的影响。研究内容：(1) 建立大鼠原位肝移植AR模型及非AR模型，检测供肝KCs中PI3Kγ与PKM2的表达水平，分析KCs中PI3Kγ与PKM2的表达水平与肝移植AR的相关性。(2) 使用过表达PI3Kγ的腺相关病毒(AAV-PI3Kγ)处理供体大鼠，建立过表达PI3Kγ的大鼠模型，LPS于体外激活供肝中的KCs，检测M1/M2分子标记物的表达水平以及KCs的糖酵解水平，同时检测KCs中PKM2的聚合状态、PKM2第105位酪氨酸及第37位丝氨酸磷酸化水平、PKM2在KCs中的核转位情况以及PKM2下游主要糖酵解相关通路的激活情况。使用PKM2的抑制剂Compound 3K阻断PKM2的酶活性，检测KCs中M1/M2型巨噬细胞分子标志物的表达水平。(3)过表达PI3Kγ的LEW大鼠作为供体，BN大鼠作为受体，使用脂质体包裹的氯膦酸盐去除供体内包括KCs在内的所有巨噬细胞，然后建立原位肝移植AR模型，术中经门静脉过继回输未经处理的KCs或过表达PI3Kγ的KCs，术后评估肝移植AR的程度。研究结果：(1)移植肝中的KCs及LPS激活后 KCs中PI3Kγ及PKM2表达上调，过表达PI3Kγ能抑制KCs糖酵解并促进其M2极化，且PI3Kγ对KCs M2极化的促进作用及糖酵解的抑制效应能被高糖所削弱；(2) 过表达PI3Kγ能抑制PKM2二聚化、促进其四聚化，下调KCs中PKM2第105位酪氨酸及第37位丝氨酸的磷酸化水平并抑制KCs中PKM2的核转位，抑制PKM2下游Myc, HIF-1α及mTORC1等糖酵解相关的代谢通路的激活； Compound 3k能明显削弱PI3Kγ对KCs M2极化的作用；(3) 过表达供体PI3Kγ能抑制肝移植AR，且KCs耗竭能削弱PI3Kγ对AR的抑制作用，而过继回输未经处理的KCs及过表达PI3Kγ的KCs能明显恢复PI3Kγ对大鼠肝移植AR的抑制作用。结论：本研究在肝移植AR、KCs极化及糖酵解之间建立桥梁，