拟穴青蟹新抗菌肽SCY2交配诱导表达特性及其生殖免疫功能的研究

SCY2是在我国重要海水养殖拟穴青蟹（简称青蟹）中发现的一种新抗菌肽，前期研究表明SCY2基因在雄性青蟹射精管中高表达，细菌感染不诱导其表达，而在青蟹繁殖高峰期SCY2表达水平显著升高，推测SCY2受交配诱导表达，具有生殖免疫功能，生殖免疫对于保障青蟹亲体质量和胚胎发育等具有重要意义。本课题拟在前期工作基础上，研究交配诱导后SCY2基因和蛋白在青蟹交配-受精-抱卵期间的表达水平变化，阐明SCY2的交配诱导表达特性。研究SCY2在交配过程中对精子的保护作用以及在受精和胚胎发育过程中的作用，揭示SCY2自交配至胚胎发育过程中的生殖免疫功能。通过研究SCY2的互作蛋白，进一步解析SCY2 的功能。筛选SCY2重要抗菌结构域，确定其抗菌特性，并阐明其抗菌机理。该项研究将为维护青蟹亲体和胚胎健康，解决我国青蟹人工育苗中的关键科学问题等提供科学依据。

青蟹是我国南方最重要的海水养殖蟹类品种，近些年来，随着青蟹养殖规模不断扩大，多种病害频繁发生引起养殖青蟹大量死亡，严重影响了我国青蟹养殖业的发展。青蟹以先天性免疫为主，抗菌肽是先天性免疫系统中重要免疫因子，对抵抗病原微生物感染具有重要作用。SCY2是课题组近些年来在青蟹中发现的又一种新型阴离子抗菌肽，前期研究表明SCY2基因在雄性青蟹射精管中高表达，细菌感染不诱导其表达，而在青蟹繁殖高峰期SCY2表达水平显著升高，推测SCY2具有生殖免疫功能。本课题系统研究了自然状态下青蟹各组织器官中Scy2基因的表达规律，发现雄性青蟹射精管表达量最高，其它组织以及雌性青蟹体内的多器官和组织也有微弱表达；研究了胚胎至幼体不同发育阶段SCY2的表达特性，在胚胎发育Ⅱ期SCY2基因表达量相对较高，在其它几个时期较低；研究了LPS、细菌及真菌感染条件下青蟹SCY2的表达特性，发现微生物感染不能诱导SCY2表达；在交配诱导条件下，青蟹抗菌肽SCY2有显著的诱导表达变化，交配后雄性青蟹射精管的SCY2基因表达量比交配前SCY2的表达量低，但在后射精管、阴茎和雌蟹纳精囊中交配后SCY2的表达量比交配前高，交配后雌性纳精囊中有明显的SCY2蛋白分布，结合SCY2随青蟹发育的季节性表达规律，发现SCY2的诱导表达模式与青蟹的性成熟规律一致，推测激素水平变化与SCY2的表达相关；进一步研究了激素诱导下青蟹抗菌肽SCY2的表达模式，发现孕酮对SCY2的基因表达有显著影响，从而阐明SCY2的表达模式是交配诱导表达，说明其表达特性与生殖免疫功能相关。利用酵母双杂交系统对SCY2的可能互作蛋白进行了高通量筛选，获得了一个与SCY2互作的蛋白cDNA序列，命名为ScyIP，并对互作蛋白ScyIP进行了功能验证，发现ScyIP在雌性和雄性青蟹多组织器官中有表达，具有抗微生物活性且可引起细胞凋亡。利用真核系统获得的SCY2表达产物，体外抗菌活性试验表明主要抗革兰氏阳性菌，而体内的抗菌活性试验发现，SCY2蛋白与海洋动物致病菌副溶血弧菌共孵后其青蟹的存活率有较显著提高，说明SCY2蛋白在青蟹抵御病原微生物过程中可发挥重要的免疫作用。该项研究将为维护青蟹亲体和胚胎健康，解决我国青蟹人工育苗中的关键科学问题等提供科学依据。