拟穴青蟹新型抗真菌肽的机制及其功能研究

Antibacterial peptides (AMPs) are known to have important application value, but only a few of them have strong antifungal activity. Fungal infections pose a serious threat to humans, animals and plants. Natural antifungal peptides (AFPs) will be the major biological products that could control fungal infections in the future. AFPs derived from marine animals have only been found individually and lack in-depth study on their mechanisms. Previous studies showed that a gene Sp-AMP screened from the transcriptomic analysis of Scylla paramamosain responds to pathogen infection in vivo and has antibacterial activity in vitro. Preliminary studies have indicated that the Sp-AMP domain has strong antifungal activity. In this project, we aim to further study the expression characteristics of Sp-AMP in normal mature crabs and infected crabs; obtain its engineered expression product and identify the best antifungal active peptide; map their antifungal spectrum; investigate its localization in fungal cells, and its effect on the ultrastructure of fungi, fungal cell wall (membrane), nucleic acid, and cell apoptosis which could clarify its anti-fungal mechanism in vitro; detect its cytotoxicity and anti-tumor activity; and then verify its anti-fungal activity in crab and mice. This study will provide a potentially useful antifungal product in agriculture, aquaculture and medicine.

已知抗菌肽具有重要的应用价值，但有强抗真菌活性的抗菌肽报道较少。真菌感染给人类和动植物造成了严重的威胁，天然抗真菌肽将是未来控制真菌感染的主要生物制品。源于海洋动物的抗真菌肽，仅有个别发现且缺乏对其机制的深入研究。前期研究利用转录组从拟穴青蟹中筛选获得了一个在体内应答病原感染且在体外有抗菌活性的基因Sp-AMP，初步研究表明该基因结构域具有强抗真菌活性。本项目拟在此基础上，继续深入研究自然状态和人工感染下Sp-AMP基因在成熟青蟹体内的表达特性；获得其基因工程表达产物并筛选出最佳抗真菌活性肽段，绘制出抗真菌谱；通过研究其在真菌细胞中的定位、对真菌超微结构的影响、对真菌细胞壁（膜）与胞内核酸的作用、对真菌细胞凋亡的影响等，阐明该肽在体外的抗真菌机制；并检测其细胞毒性和抗肿瘤活性；以及验证其在青蟹和小鼠体内的抗真菌活性。本研究将提供一种在农业、水产养殖业和医药等具有潜在应用价值的抗真菌制品。

侵袭性和持续性真菌感染对人类健康造成了严重威胁，特别是对于住院和免疫功能低下的患者。目前治疗侵袭性真菌病的临床一线药物种类较少，且具有一定的毒副作用，长期临床使用还会导致耐药株的产生，增加治疗的难度。因此，迫切需要研发新型的抗真菌药物以解决真菌病原体的威胁和现有抗真菌药物的局限性。抗菌肽是一类具有广谱抗微生物活性和和免疫调节作用的小分子多肽，能够有效抑杀细菌和真菌，且不易使病原菌产生耐药性等特点，在临床医药等领域具有良好的应用前景。本研究利用分子生物学等技术从雄性拟穴青蟹性腺中筛选获得一个新型抗菌肽基因，命名为Sparamosin。该基因在青蟹的性腺及肌肉组织中表达量最高，且在副溶血弧菌感染的青蟹肌肉组织中被显著诱导表达，暗示其参与了青蟹的免疫响应。通过化学合成方法获得Sparamosin成熟肽及其截短肽Sparamosin1-25和Sparamosin26-54。体外抗菌实验结果表明Sparamosin26-54具有广谱和强的抗细菌及真菌活性，特别是对人类重要致病真菌新型隐球菌有较强的抗菌及抗生物膜活性。转录组分析结果表明，新型隐球菌在Sparamosin26-54处理后，其细胞壁合成、细胞壁完整性信号通路，抗氧化应激、细胞凋亡、DNA修复、麦角固醇合成通路以及线粒体氧化磷酸化等相关基因被显著调节。进一步对其作用机制的研究结果揭示了Sparamosin26-54可能通过破坏微生物膜完整性、改变线粒体膜电位、诱导真菌发生凋亡等多重作用途径发挥其抗菌作用。此外，该青蟹新型抗菌肽具有高效快速的杀菌活性，同时没有溶血活性及细胞毒性，且在大蜡螟幼虫的活体实验中具有一定的免疫保护作用，有望开发为具有良好应用前景的抗真菌药物。