Raf激酶抑制蛋白在肝纤维化胶原代谢中的作用机制

Hepatic fibrosis results from chronic liver damage and is characterized with the hepatic stellate cell (HSC) activation and extracellular matrix (ECM) accumulation. Our previous study has found that the Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is down-regulated after HSC activation, inhibits HSC proliferation, but promotes HSC migration. In the current study, RKIP adenovirus over-expression vector and RNAi are used to treat primary HSC, HSC cell lines (HSC-T6 and LX-2) and the liver fibrosis animal models. RKIP, collagen, matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase factor (TIMPs) will be detected by RT-qPCR, Western blot, and immunofluorescence histochemistry. ELISA will be used to detect the activity of MMPs and TIMPs. The relative amounts of activated MMPs and TIMPs will be calculated. The protein levels of signaling molecules, such as Raf-1/MEK/ERK1,2 and NF-κB, will be detected by Western blot, scanned and analyzed. The current research will clarify the regulatory mechanisms of RKIP on collagen synthesis, secretion, deposition and degradation by HSC during liver fibrogenesis. This study will provide a new theoretical basis and molecular targets for prevention and treatment of hepatic fibrosis.

肝纤维化是由不同病因引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共同病理改变，肝星状细胞（HSC）活化伴细胞外基质（ECM）异常沉积是其中心环节。前期研究证实Raf激酶抑制蛋白(RKIP)在HSC活化后表达下降，RKIP抑制HSC增殖但促进其迁移。本课题以原代HSC、HSC细胞株及肝纤维化动物模型为研究对象，以RKIP腺病毒过表达载体和RNAi作干预，用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光组织化学方法检测RKIP、胶原蛋白、基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的表达，ELISA检测活化MMPs与TIMPs活性并计算两者相对量，Western blot检测Raf-1/MEK/ERK1,2和NF-κB信号通路传导情况。通过本项研究可以阐明肝纤维化时RKIP对HSC胶原合成、分泌、沉积与降解的作用机制。此课题的开展将为肝纤维化预防和治疗提供新思路并揭示可能的分子靶点。

肝纤维化是由不同病因引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共同病理改变，肝星状细胞（HSC）活化伴细胞外基质（ECM）异常沉积是其中心环节。前期研究证实 Raf 激酶抑制蛋白(RKIP)在 HSC 活化后表达下降，RKIP 抑制 HSC 增殖但促进其迁移。本课题以HSC 细胞株（LX-2）及肝纤维化小鼠为研究对象，用RKIP 腺病毒过表达载体、RNAi腺病毒载体和RKIP特异性抑制剂Locostatin作为干预因素，研究RKIP在胶原代谢过程中的作用。体外肝星状细胞实验证实，RKIP过表达可下调I型胶原、MMP1和MMP2的mRNA表达，上调MMP7和MMP9的mRNA表达；RKIP低表达可以上调I型胶原、MMP1、MMP7和MMP9的mRNA表达，ELISA显示I型胶原减少, MMP1升高；Locostatin干预后RT-qPCR、Western Blot和ELISA检测显示I型胶原减少，MMP-1、TIMP-1和MMP-2、TIMP-2表达升高，RT-qPCR发现Locostatin也可以减少III、IV型胶原表达；细胞黏附实验证示，RKIP可以减少肝星状细胞在I型胶原、纤维连接蛋白和matrigel胶上黏附。肝纤维化是肝脏长期损伤修复反应形成的一种病理状态，本研究选择四氯化碳小鼠腹腔注射的方法构建肝纤维化模型，干预因素与细胞实验相同。RKIP过表达后，肝组织炎症反应较重，免疫组织化学染色提示III型胶原沉积减少，Western Blot提示I型和IV型胶原蛋白表达升高；RNAi腺病毒载体和Locostatin干预后，免疫组织化学染色和Western blot提示I型胶原表达减少，ELISA 提示MMP-13/TIMP-1比值升高，RT-qPCR和Western blot发现Locostatin可以减少III型胶原表达，Locostatin还可以减轻肝纤维化小鼠肝功能损伤和减少肝脏组织炎性细胞浸润；Western Blot方法证实外源性RKIP 可以抑制Raf-1/MEK/ERK1,2 和NF-κB 信号通路，RKIP低表达后两条信号通路活性增强。综上，体内外研究发现抑制RKIP表达可以减少I型胶原沉积，Locostatin可以延缓肝纤维化进程。