Raf激酶抑制蛋白在肝纤维化发生机制中的调控作用

Liver fibrogenesis has close relationship with Raf-1/MEK/ERK1,2 signal pathways. As the signaling pathways inhibitory factor, whether Raf inhibiting protein kinase (RKIP) has an important regulation role in liver fibrosis? Which aroused our great interest, and prompt us to further research it continually. Based on our previous series studies, We will use the chemical-, and immune-induced liver fibrosis in rats as the animal model of hepatic fibrosis respectively, and detect the distribution and content of RKIP and the activation of ERK protein in liver during different periods of liver fibrogenesis, which will explore the correlation between the activation of Raf-1/MEK/ERK1,2 signal pathway and the expression and phosphorylation level of RKIP. Besides, to investigate the role of RKIP in HSCs proliferation, apoptosis and migration, the phosphorylation levels of RKIP, ERK will be examined during HSCs activation, and with the use of plasmid transfection, siRNA technology respectively, the expression of RKIP will be also assessed during HSCs culture. In sum, this study will elucidate the molecular mechanisms of RKIP on Raf-1/MEK/ERK1,2 signaling pathway in liver fibrosis, which will provide a new insight into the target and solution for the treatment of hepatic fibrosis.

肝纤维化与Raf-1/MEK/ERK1,2信号传导有密切关系，而Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是该信号通路的抑制因子，是否意味着RKIP在肝纤维化中具有重要的调控作用？引起了我们极大兴趣和深入研究。基于前期系列研究的基础上，我们拟采用化学性和免疫性肝纤维化大鼠模型，研究RKIP在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量变化，以及信号通路蛋白ERK的活化情况，探讨肝纤维化进程中Raf-1/MEK/ERK1,2信号通路的激活与RKIP的表达和磷酸化水平的相关性；用体外细胞模型，检测RKIP、ERK在活化HSCs中的磷酸化水平；以及采用质粒转染和siRNA技术分别过表达、沉默RKIP，综合分析RKIP对HSCs增殖、凋亡和迁移的影响。本研究将阐明RKIP 介导Raf-1/MEK/ERK1,2 信号通路在肝纤维化中的调控作用机制，为探索干预肝纤维化新靶点提供新的思路。

肝纤维化是慢性肝病发展到一定程度的共同病理特征，其特点是细胞外基质（ECM）的过度沉积。前期研究表明，ERK/MAPK信号通路在活化的肝星状细胞（HSCs）中通过调节ECM的合成而在肝纤维化发生机制中发挥重要调控作用。Raf激酶抑制蛋白（RKIP）是ERK/MAPK信号通路的特异性阻滞因子，它通过抑制ERK/MAPK通路而参与到许多肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭和转移过程。虽然RKIP在肿瘤发生机制中的作用已被充分揭示，但其在肝星状细胞和肝纤维化中的作用仍不清楚。为了阐明这个问题，首先，我们分别采用CCl4和猪血清诱导大鼠肝纤维化动物模型，检测RKIP在动物肝纤维化发生发展不同阶段的表达情况，旨在了解RKIP表达水平与肝纤维化程度的相关性。另外，采用locostatin特异性阻断RKIP的表达，探讨在RKIP缺失的情况下大鼠肝纤维化的病变情况。其次，采用siRNA技术沉默RKIP基因和质粒转染过表达RKIP，分别研究RKIP在缺失和高表达的情况下对大鼠原代肝星状细胞、HSC-T6细胞和人肝星状细胞（LX-2）增殖、集落形成、凋亡、细胞周期的影响及其机制。最后，为了探讨RKIP在治疗肝纤维化中的潜在靶向作用，我们进一步研究了RKIP靶向药物（香蜂草苷）对大鼠肝纤维化的影响。我们发现，不论是CCl4还是猪血清诱导的肝纤维化，随着时间的推移，肝纤维化程度在加重，RKIP的表达也随之降低；同时，采用locostatin干预后，实验发现RKIP低表达可明显诱导胶原的过度形成，导致肝纤维化恶化。此外，体外细胞实验发现，RKIP的缺失可引起肝星状细胞活化增殖、抑制其凋亡、促进胶原形成，而 RKIP过表达则可逆转这种情况。由此，我们推测RKIP的表达水平与肝星状细胞活化增殖、肝纤维化程度呈负相关，也就是说，提高RKIP表达有可能是治疗肝纤维化的一个有效靶点。为了进一步验证这一推测，我们研究了RKIP靶向药物（香蜂草苷）对肝纤维化的影响，结果发现该药确实能抑制HSCs活化增殖、减轻大鼠肝损伤和纤维化程度，即提高RKIP水平可减轻肝纤维化。本研究为了解肝纤维化的发病机制及新的潜在治疗靶点提供了新的视角，在慢性肝病基础研究方面显示出较高的学术价值和潜在临床应用价值。