肺腺癌中SPLUNC1基因启动子区Snail调控元件功能的研究

SPLUNC1（YH1）基因是本课题组最早克隆的基因。近期研究表明，SPLUNC1与肺腺癌的发生、发展密切相关。在生物信息学分析的基础上，我们应用凝胶迁移阻滞实验（EMSA）和染色质免疫沉淀实验（ChIP）证实SPLUNC1基因启动子区存在Snail结合位点，且瞬时干扰Snail因子表达后可引起SPLUNC1基因的表达降低。为深入研究Snail因子对SPLUNC1基因在肺腺癌中表达的调控效应，本研究拟构建不同长度含有潜在Snail结合位点和结合位点突变型的启动子报告基因载体，分析其活性变化；应用超级EMSA和ChIP实验对Snail调控元件进行鉴定；同时采用基因转染和RNA干扰技术，分析Snail表达上调和下调对SPLUNC1基因启动子活性、表达水平及肿瘤细胞生物学行为的影响。研究将阐明Snail调控SPLUNC1基因表达的机制，为深入揭示SPLUNC1基因在肺腺癌中的生物学功能提供依据。

研究表明，SPLUNC1在正常肺组织内不表达，而在肺腺癌中表达水平明显增高，且是肺癌患者淋巴结早期转移的标志物之一，但其在肺腺癌中的功能及调控机制仍不明确。本研究利用免疫组化、western blot及RNA干扰技术检测了SPLUNC1在肺腺癌中表达水平的临床意义并鉴定了其生物学功能。在生物信息学分析的基础上，利用启动子报告基因系统、EMSA、ChIP、基因转染及RNA干扰技术，验证了SPLUNC1基因启动子的确切位置及其反式作用元件Snail在其表达调控中的作用。我们发现，SPLUNC1蛋白在肺腺癌组织中高表达，其表达水平与肿瘤的大小，T 分期， N 分期以及远处转移密切相关，且SPLUNC1的过表达是肺腺癌患者不良预后的一个独立指标。RNA干扰技术抑制肺腺癌细胞中SPLUNC1的表达后，能在体内外抑制肺腺癌细胞的增殖及侵袭能力。在生物信息学预测的基础，利用PCR技术构建了一系列SPLUNC1基因启动子片段的截短子及突变体，荧光素酶报告系统检测确定了SPLUNC1 基因启动子位于-467~+200bp间，且-149~-144bp 的Snail结合位点是SPLUNC1基因启动子区关键的调控元件。通过EMSA和ChIP实验也证实Snail在体内外可以和SPLUNC1基因启动子区该位点结合。过表达Snail后能够引起SPLUNC1基因启动子活性及蛋白表达水平的增高；Snail过表达能够促进肺腺癌细胞的生物学能力，而抑制SPLUNC1表达后能够部分减弱Snail对肺腺癌细胞生物学能力的影响。抑制Snail表达后同样可引起SPLUNC1启动子活性及蛋白表达水平的降低；下调Snail表达后，能回复SPLUNC1过表达对肿瘤细胞增殖及侵袭能力的促进作用。本研究明确了SPLUNC1在肺腺癌中过表达的临床及生物学功能意义；在此基础上进一步探讨了Snail转录因子在SPLUNC1基因过表达中的调控意义。