HBx表观调控Wnt拮抗基因SFRPs的分子机制及效应研究

Wnt/β-catenin信号异常活化是HBV相关肝癌发生的致病因素之一，但其具体机制不明。Wnt拮抗基因SFRPs启动子区的超甲基化修饰可导致β-catenin的过度活化；HBx生物学功能活跃，与HCC发生密切相关，但是HBx能否参与SFRPs表观遗传调控，未见研究报道。我们的前期工作证实HBx能诱导β-catenin活化与核转位；HBx通过对SFRP1,5基因启动子区的甲基化修饰，下调其表达；SFRPs基因表达的严紧调控对肝细胞正常增殖与分化具有重要作用。本项目拟在此基础上，深入分析HBx调控SFRPs基因启动子活性和启动子区甲基化修饰酶、组蛋白修饰酶的动态结合，以及表观遗传调控分子之间、表观遗传调控分子与转录因子之间的相互作用，获知HBx表观调控SFRPs基因的分子机制。本项目的实施将对探索HBV参与表观遗传调控及其机制提供理论依据和实验基础，同时对研究HBV的致病机制具有重要意义。

肝细胞肝癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人们的身体健康，乙型肝炎病毒感染是HCC发生的重要诱因。HBV感染引起HCC的具体机制尚未完全阐明，课题组在前期实验结果基础上，拟研究HBx是否通过对Wnt信号拮抗分子SFRPs的表观遗传调控，参与病毒感染引起的Wnt信号通路过度活化，并导致肝细胞异常增殖和恶性转化。我们观察了HBx对Wnt信号拮抗基因SFRPs的表达调控，研究HBx对SFRPs基因启动子活性以及启动子区甲基化修饰的调控。深入分析HBx诱导的DNA甲基化转移酶、甲基化结合蛋白、组蛋白修饰酶以及特异转录因子等在SFRP基因启动子区的结合变化，并进一步探讨HBx对SFRPs基因靶向表观遗传调控的效应研究。. 实验发现：1．在肝癌细胞模型中过表达以及稳定表达HBx均可以明显下调SFRP1，5基因的表达，去甲基化药物5’-氮-2’-脱氧胞嘧啶（DAC）和/或HDAC抑制剂TSA单独或联合处理细胞，SFRP1，SFRP5基因的表达能够得到有效回复；2. 肝癌组织中SFRP1、SFRP5的表达明显低于其在癌旁组织中的表达，肿瘤组织中SFRP1、SFRP5的甲基化概率明显高于其在相应癌旁组织中的概率；3. 统计学分析表明，肿瘤组织中SFRP1、SFRP5启动子区的甲基化概率与DNMT1的表达呈正相关，而SFRP1、SFRP5的表达水平则与DNMT1的表达呈负相关；4. HBx可以明显诱导甲基化相关蛋白DNMT1、MBD1及MBD2等富集于SFRP1、SFRP5基因启动子区；5. HBx可以上调DNMT1、DNMT3A以及HDAC1的表达，并且通过直接与DNMT1、DNMT3A、HDAC1的直接结合，共同参与SFRPs的表观调控；6. DAC和/或TSA处理能够回复由HBx诱导的DNA甲基化转移酶、组蛋白乙酰化转移酶在SFRP1、SFRP5基因启动子区的富集。7.沉默DNMT1后或过表达SFRP1、SFRP5后，抑制HBx稳定表达的肝癌细胞增殖、迁移，和Wnt信号通路的活化，抑制荷瘤鼠肿瘤增殖与迁移能力。. 通过本项目实施，我们从基因表达和启动子区表观修饰水平较为系统和全面地研究了HBx对SFRPs基因的表观调控机制，并验证了此种表观修饰在参与肝细胞增殖和恶性转化中的致病机制。项目的实施对了解HBV的致病机制具有重要意义。