HCV核心蛋白诱导sFRPs和DKK转录表观遗传沉默的分子机制研究

Wnt/β-catenin信号的异常活化是HCV相关肝癌发生的重要致病因素之一，Wnt抑制基因sFRP和DKK启动子区超甲基化修饰可导致β-catenin过度活化。我们前期工作证实HCV核心蛋白通过触发Wnt/β-catenin信号通路，促进肿瘤细胞的异常增殖和分化；同时，在过表达HCV核心蛋白的肝癌细胞系中，sFRP1, sFRP4和DKK1的表达明显下调，采用甲基化酶抑制剂DAC处理，上述基因的表达能够部分回复。本项目拟在此基础上，采用表观遗传学方法探索HCV核心蛋白对SFRP和DKK基因启动子区甲基化的直接调控，研究HCV核心蛋白诱导sFRPs和DKK转录表观遗传沉默在肝癌发生中的作用。本项目的实施将对深入了解HCV参与Wnt通路表观遗传修饰的机制具有重要的意义，同时也为研究HCV的致病机制及治疗药物靶标奠定分子基础。

Real-time PCR和Western blot实验在核心蛋白过表达的瞬时感染肝癌细胞及稳定表达肝癌细胞模型中， Wnt 信号通路抑制分子SFRP1 的表达明显下调。采用甲基化转移酶抑制剂(DAC)对细胞进行去甲基化处理，SFRP1 的表达能够得到部分恢复，且恢复程度与DAC 浓度呈剂量依赖关系。甲基化特异性PCR 以及亚硫酸盐DNA 测序实验证实核心蛋白能够引起SFRP1基因启动子区高甲基化修饰。通过进一步对核心蛋白促进SFRP1 启动子区甲基化调控的分子机制的研究发现: 在核心蛋白过表达的Huh7 细胞中，DNMT1 及HDAC1 蛋白表达量明显上调，同时核心蛋白可募集DNMT1 和HDAC1 结合到SFRP1 启动子区，抑制AcH3 与SFRP1 启动子区结合，说明核心蛋白通过促进SFRP1 启动子区甲基化与组蛋白去乙酰化协同沉默SFRP1 表达。对HCV核心蛋白的功能研究发现核心蛋白能促进细胞的增值及迁移的能力， Huh7-core细胞感染腺病毒AdSidnmt1、AdSFRP1、AdSidnmt1+ AdSFRP1后，细胞的增值及迁移能力均下降。本研究证实HCV核心蛋白对SFRP1基因启动子区甲基化的直接调控。本项目的实施对深入了解HCV参与Wnt通路表观遗传修饰的机制具有重要的意义，同时也为研究HCV的致病机制奠定分子基础。