毒素-抗毒素系统MazEFBif在长双歧杆菌JDM301酸应激调控中的作用研究

Acid stress can result the reduction of the number and activity of probiotics. The type Ⅱtoxin-antitoxin (TA) systems are special stress element and they play important roles in the bacterial stress response. Based on the complete genomic sequences of Bifidobacterium longum JDM301, our group identified an functional type ⅡTA system-MazEFBif (MazEF: a family of type ⅡTA system ) and found that MazEFBif was involved in the stress response of JDM301 to acid stress. So far, there is no report about TA system in Bifidobacterium. However, the role of MazEFBif in the acid stress regulation of JDM301, the related molecular mechanism and the relationship between MazEFBif and the other stress proteins are still unclear. Our group will further reveal the mechanism of activation and function of MazEFBif and find the interaction proteins of MazEFBif in the acid stress response by proteomic approache and bacterial two-hybrid analysis. Furthermore, the relationship of MazEFBif and its interaction proteins and the related mechanisms will be explored by protein-protein interaction analysis and protein-DNA interaction analysis. The investigation of MazEFBif and its interaction proteins will bring us deeper insight into the mechanism regulating the acid stress response of Bifidobacteria and be helpful to improve the survival rate of Bifidobacterium-related products during the passage of stomach .

酸应激是导致益生菌制品活菌数目减少、菌体活性降低的重要因素之一。研究表明Ⅱ型毒素-抗毒素(TA)系统是一种特殊的压力反应元件，与细菌的压力反应调控过程密切相关。本课题组在获得长双歧杆菌JDM301全基因组数据的基础上，在其基因组中鉴定出功能Ⅱ型TA系统MazEFBif（MazEF：Ⅱ型TA系统中的一个家族），并发现MazEFBif参与菌株的酸应激反应，目前国际上尚未见相关报道。然而MazEFBif在JDM301酸应激调控网络中的作用、与其他应激蛋白的关系及相关分子机制尚不清楚。本项目拟在明确MazEFBif激活及作用机制基础上，结合蛋白质组学和细菌双杂交技术筛选JDM301酸应激过程中MazEFBif作用蛋白，并通过蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用分析技术鉴定上述相互作用关系。本项目的开展对挖掘双歧杆菌新的酸应激调控机制和解决目前双歧杆菌制剂过胃时存活率偏低的现象具有重要价值和意义。

本项目围绕长双歧杆菌JDM301基因组中Ⅱ型毒素-抗毒素系统-MazE1F1Bif如何参与酸应激调控这一科学问题，探讨MazE1F1Bif激活及作用机制，寻找MazE1F1Bif相互作用蛋白。我们发现：.1）、毒素蛋白MazF1Bif与同源抗毒素蛋白MazE1Bif能够相互结合；该毒素蛋白具有核酸酶活性、其毒性可被其同源抗毒素蛋白MazE1Bif抑制；.2）、毒素蛋白MazF1Bif能够分别与其非同源抗毒素蛋白MazE2Bif、RelBBif相互结合，形成蛋白复合物；.3）、MazF1Bif具有核酸酶活性，能够引起tufABif mRNA的降解；而MazF1Bif的非同源抗毒素蛋白MazE2Bif或RelBBif与其共表达则可以逆转MazF1Bif导致的tufABif mRNA降解；. 4）、MazF1Bif对宿主细胞的毒性作用不仅能被同源抗毒素MazE1Bif中和，还能被非同源抗毒素MazE1Bif和RelBBif中和；.5）、酸应激状态下蛋白酶ClpPXBif表达升高，ClpPXBif高表达引起抗毒素蛋白MazE1Bif（BLJ_812）的降解，从而导致MazE1F1Bif系统的激活。.6）、拓展研究发现JDM301中另一毒素-抗毒素系统RelBEBif中的毒素蛋白RelEBif具有核酸酶活性，可降解tufABif mRNA；该系统参与JDM301渗透压应激下的调控反应。. 上述研究结果表明：JDM301酸应激状态下clpP1Bif和clpP2Bif表达升高，增多的蛋白酶ClpP1XBif、ClpP2XBif引起MazE1Bif的降解，引发酸应激状态下毒素-抗毒素系统MazE1F1Bif的激活、游离毒素蛋白MazF1Bif增多发挥毒性作用，导致mRNA的切割、菌体蛋白合成减少、菌体代谢水平降低，有利于菌体在酸应激状态的存活；JDM301基因组中的三个功能毒素-抗毒素系统具有交叉相互作用，这一相互作用网路可能在菌株的酸应激反应过程中发挥重要作用。本项目首次对毒素-抗毒素系统参与双歧杆菌的酸应激机制进行了阐释，为优良双歧杆菌益生菌株的筛选提供理论依据。