PLGA微球局部控制释放VEGF和BMP-2基因促骨再生作用的研究

In order to solve the problem of insufficient vascularization in bone regeneration,through mimicking the nature secretion sequence of growth factors may promote the angiopoiesis and osteogenesis of mesenchymal stem cells. Based on our previous works, PLGA microspheres were prepared. The release rate of the microspheres can be control by adjusting the ratio between PLA and PGA. In this study we will prepare PEI-alginate/pVEGF and PEI-alginate/pBMP-2 loaded PLGA microspheres with different release rate. Scanning electron microscopy and atomic force microscopy will be used to characterize its structure, ultraviolet spectrophotometer will be used to investigate the release of control. The purpose is to screen the best microspheres preparation technique for vascularization and bone formation. MTT assay, RT-qPCR and Western Blot will be used to study the effects of VEGF and BMP-2 gene loaded microspheres on proliferation, differentiation and function of BMSCs. Micro-CT, histology and immunohistochemistry techniques will be further used to examine the effects of VEGF and BMP-2 gene loaded microspheres combined with stem cell sheet on rat skull bone regeneration. This study will lay the foundation for treating bone defects using VEGF and BMP-2 gene loaded microspheres.

骨缺损修复过程存在血管化程度不足的问题，通过模拟生长因子的体内释放规律，可能促进干细胞的成血管和成骨分化功能。在前期合成的PLGA微球的基础上，通过改变PLA和PGA的比例调节PLGA微球的释放速率，制备不同释放速率的载VEGF和BMP-2基因的PLGA微球；扫描电镜和原子力显微镜表征其形貌特征，紫外分光光度计探讨基因控制释放规律，筛选与血管和骨再生相匹配的的载VEGF和载BMP-2基因的PLGA微球制备技术；体外研究将载VEGF和BMP-2基因的PLGA微球与细胞共培养，利用MTT、Realtime-PCR、Western blot等方法，研究其对BMSCs的增殖和分化功能的影响；体内研究向大鼠的颅骨临界骨缺损中植入可控释放VEGF和BMP-2基因的PLGA微球和BMSCs膜片，通过Micro-CT、组织学、免疫组织化学等测量研究其促进骨再生作用，为临床治疗口腔颌面部骨缺损奠定基础

血管内皮生长因子（VEGF）和骨形成蛋白2（BMP-2）的表达是一对偶联过程，通过两种因子间的协同作用，可促进成骨及其血管化。而生长因子在体内释放的序列对骨损伤的再生能力具有重要影响，因此本研究利用不同PLA和PGA的比例的PLGA制备了不同释放速率的载VEGF和BMP-2基因的微球，通过体内外研究探讨其体内外释放规律和促骨再生机制，筛选与血管和骨再生相匹配的的载VEGF和BMP-2基因的PLGA微球制备技术。首先通过静电力的相互作用制备聚乙烯亚胺-海藻酸钠纳米基因载体，并分别与VEGF和BMP-2质粒复合。利用复乳法分别制备载VEGF和BMP-2质粒复合物的PLGA微球（PLA:PGA=50:50、75:25和85:15），并对微球的形貌、结构和释放等性质进行表征。将微球与骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养，研究不同释放速率的微球对BMSCs成骨相关基因表达的影响。建立大鼠颅骨临界骨缺损动物模型，植入不同释放速率的载VEGF和BMP-2基因的PLGA微球和BMSCs细胞膜片，通过影像学和组织学方法评价其调控BMSCs修复骨缺损的作用。结果显示无论是何种比例的PLGA微球，在浓度为2%时形态呈分散性良好的球形，并且不同比例的PLGA微球其载药率和包封率结果相差不大，载药率约为2%，包封率约为40%。PLA 与PGA比例为50:50 的PLGA微球早期释放较快，85:15 的 PLGA 微球早期释放相对缓慢，可达到一种长效的释放过程，75:25的PLGA微球释放介于二者之间。Realtime PCR结果表明VEGF与BMP-2对于BMSCs成骨分化具有协同促进的作用，并且在早期时BMP-2快速释放组成骨基因升高更加显著，而到了晚期VEGF快速释放组相对于其他组成骨基因的升高更加显著。因此本研究成功制备了不同释放速率的载VEGF和BMP-2基因的 PLGA 微球，并探讨有序释放VEGF和BMP-2基因对BMSCs成骨分化功能的影响。