兼具骨诱导与促血管化的锶/丝素蛋白可注射多孔微球用于骨再生

The basic pathologic property of avascular necrosis is damage of blood supply in accompany with decreased amount and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Therefore, the construction of microenvironment to promote adult stem cell osteogenic differentiation, improve the femoral head blood supply, and promote regeneration of new bone, could be effective in the treatment of early femoral head necrosis. In addition, due to the complex internal structure of the femoral head, fabricating a bone tissue engineering scaffold allowing for easy manipulation, facilitate implant and fills the necrotic area may achieve the desired therapeutic effect. In our previous work, we have prepared injectable porous polyamine acid microspheres that mixed with chondrocytes and injected subcutaneously in nude mice can generate cartilage. The publications found that strontium can promote osteogenic differentiation of adult stem cells and angiogenesis. Based on above results, we hypothesized that preparing injectable microcarriers of high cell density loads, osteogenic and vascular regeneration by porous microspheres load strontium would improve the therapeutic effect of femoral head necrosis. The task will use silk fibroin that can analog protein component of extracellular matrix to prepare porous microspheres. Moreover, we will construct bone marrow mesenchymal stem cells loaded engineering bone use the above microspheres containing strontium as injectable for repair of rabbit avascular necrosis, and provide experimental evidence for the application of using microcarriers-based new scaffold materials repairing the bone defect.

缺血性股骨头坏死在病灶区存在血供受到破坏、骨髓间充质干细胞数量减少及活力降低的关键性病理机制。因此，构建在体内持续促进成体干细胞成骨分化，改善股骨头血供，促进新骨再生的微环境，可有效治疗早期股骨头坏死。同时，股骨头内部结构复杂，在保髋情况下方便植入骨修复材料，使其填满坏死区，可达到理想的治疗效果。申请者前期已制备出大孔径聚氨基酸多孔微球，具有可注射性，且能高密度负载种子细胞实现骨再生。研究表明，锶可促进成体干细胞成骨活性及促进血管新生的效果。本项目将通过多孔微球复合锶元素，构建具有高细胞密度负载、促成骨和血管再生能力的可注射微载体，以可提高股骨头坏死治疗效果。研究采用具有模拟细胞外基质蛋白质成分的丝素蛋白为微载体主要材料，锶为促干细胞成骨分化及促血管化诱导因子，负载骨髓间充质干细胞，通过可注射植入途径在动物体内治疗缺血性股骨头坏死，为应用微载体新型支架材料修复骨缺损的实施提供研究依据。

基于组织工程支架和干细胞的再生医学技术，可重建或改善骨血供，促进新骨再生，为骨组织缺损修复重建提供了一种全新的治疗途径。然而，常规三维块状支架应用于骨组织工程存在两大主要问题：1. 负载干细胞的骨支架材料缺乏骨诱导活性；2. 难以植入一些具有特殊解剖位置和复杂结构的骨组织缺损部位。本项目设计了具有骨诱导活性的锶掺杂的丝素蛋白多孔可注射微载体，开展的主要研究工作内容包括：a. Sr/SF多孔微载体制备研究；b. Sr/SF多孔微载体理化特征分析；c.Sr/SF多孔微载体的生物相容性及生物功能性研究；d.构建动物骨缺损模型与治疗研究。研究了微载体制备工艺参数，构建了具有锶离子缓释能力的多孔微载体。氯化锶在0.01 g到0.4 g添加范围内，当冷冻温度为−20 oC，丝素蛋白溶液浓度为2.5%(wt)时，制备的氯化锶掺杂丝素蛋白多孔微载体且具有较好的球状形貌，孔径为20-25 µm，孔隙率超80%。为克服锶离子的流失，开展了将氯化锶转变成具有离子缓释作用的矿化物的研究工作。通过获得锶矿化的丝素蛋白多孔微载体，实现了锶离子的持续缓释。当微球浸泡时间分别为6天9天12天15天时，缓释的锶离子浓度对应为55.5 ppm，66.9 ppm，39.9 ppm，18 ppm。开展了不同微载体样品体外降解的失重情况和降解产物的形貌及pH变化规律的研究工作。研究了微载体接种骨髓间充质干细胞的细胞相容性，结果表明微载体能有效地支持骨髓间充质干细胞的黏附、增殖与生长。测试了微载体的细胞毒性和血液相容性，结果表明微载体没有表现出明显的细胞毒性和溶血性能。测试了微载体的生物功能性，发现锶丝素微载体能促进BMSCs向成骨细胞分化。在第7天和第14天，含锶微载体实验组的ALP活性、ALP基因表达量和OCN基因表达量均明显增高于丝素蛋白微载体组。开展了微载体负载骨髓间充质干细胞修复大鼠股骨缺损的工作。项目的实施为应用微载体新型支架材料修复复杂形状和特殊生理位置的骨缺损提供了研究依据。