葛仙米藻蓝蛋白脱辅基蛋白与藻蓝胆素协同抗氧化机制研究

Nostoc sphaeroides kützing，rich in phycobiliprotein especially phycocyanin, is a kind of single-cell cyanobacteria with lower evolution status. Now the antioxidant mechanism of phycocyanin is not very clear, and the electron transport pathway is still unknown when the phycocyanin play the antioxidant effect, and how the apoprotein of phycocyanin is to impact the antioxidant effect of color groups. So the aims of the study are focused on several points as mentioned bellowed, firstly, the electrochemical behavior and antioxidant effects in different antixidant system are determined, so propose a comprehensive evaluation of the antioxidant activities and evaluated the impact of enviromental factors on the antioxidant activities. Secondly, the antioxidant kinetic equation of phycocyanin is studied, in order to clarify the stability of antixidant effect. Thirdly, I would like to clear the action site of phycocyanin and the electron transport pathway when the phycocyanin play the antioxidant effect, and propose the antioxidant mechanism. The fourth, the co-antioxidant activities of apoprotein with the color group are probed and how to improve the co-antioxidant effect. The success of this research project, will play a valuable role in other types of research Phycobiliprotein antioxidant mechanism.

葛仙米是一种低等单细胞蓝藻，富含藻蓝蛋白，而藻蓝蛋白具有较强的抗氧化作用，但目前对藻蓝蛋白抗氧化作用机理尚不明确，藻蓝蛋白在发挥抗氧化作用时电子传递途径尚属未知，且藻蓝蛋白脱辅基蛋白对其藻蓝胆素抗氧化作用有何影响均不明确？鉴于此本课题拟对以下方面进行研究：（1）测定葛仙米藻蓝蛋白的电化学行为及在不同抗氧化体系中的抗氧化作用，全面评价外界环境因素对其抗氧化特性的影响；（2）葛仙米藻蓝蛋白抗氧化作用动力学研究，明确其抗氧化作用稳定性；（3）藻蓝蛋白抗氧化作用位点确定，探讨藻蓝蛋白发挥抗氧化作用时电子传递途径，提出藻蓝蛋白抗氧化机理。（4）体外分别测定大肠杆菌表达制备的葛仙米藻蓝蛋白的α和β亚基、脱辅基蛋白、藻蓝胆素的抗氧化作用，确定葛仙米藻蓝蛋白色基与其脱辅基蛋白亚基是否具有协同抗氧化作用，如何提升其协同抗氧化作用。本项目研究的成功，将为其他类型藻胆蛋白抗氧化机制的研究起到抛砖引玉的作用。

葛仙米是蓝藻门念珠藻科的低等单细胞蓝藻，是一种珍贵野生的食药两用蓝藻，富含藻蓝蛋白。目前关于藻蓝蛋白抗氧化效果研究差异较大，因此本课题围绕藻蓝蛋白抗氧化机理进行了系统研究。首先建立了藻蓝蛋白纯度测定方法，采用紫外可见光谱、HPLC、SDS-PAGE和荧光光谱进行藻蓝蛋白纯度鉴定，利用ATR中红外技术建立了藻蓝蛋白纯度测定模型。其次固体培养葛仙米成功，解析了葛仙米的全基因组，克隆葛仙米藻蓝蛋白α、β亚基，且在大肠杆菌表达，模拟其高级结构发现，α和β单亚基均含7个α-螺旋，除N端α-螺旋外，其它α-螺旋折叠形成疏水核心区；且α和β单亚基结构上能较好吻合，形成一稳定而封闭的单体，弧度近2π/3。在邻苯三酚自氧化体系中，α和β亚基对邻苯三酚自氧化有促进作用。但两种亚基均可清除ABTS+.自由基，且β比α亚基清除能力要强约12%。最后系统评估了藻蓝蛋白的抗氧化特性及其机理，循环伏安法测定发现藻蓝蛋白氧化不可逆，pH值会影响藻蓝蛋白抗氧化行为，pH5时氧化活性最高，随pH值增加，不断有质子参与藻蓝蛋白的氧化。测定5种不同藻蓝蛋白在FRAP、ABTS+·、邻苯三酚自氧化、ORAC体系的抗氧化活性，发现不同抗氧化体系藻蓝蛋白发挥抗氧化作用的基团不同，蛋白与色基部分通过不同途径起抗氧化作用。以电子转移和活性氧为主的抗氧化体系中，藻蓝蛋白抗氧化活性与蛋白部分呈正相关，基于氢原子的抗氧化体系中，与色基及纯度呈正相关。二级动力学模型可很好地的拟合葛仙米藻蓝蛋白及其它藻蓝蛋白对ABTS+·自由基的清除动力学。pH、光质及光照强度对藻蓝蛋白色基、蛋白质及其抗氧化能力影响，发现pH、光质和光照强度均会导致色基不断下降，且pH8.1的下降幅度最大，但蛋白质部分和在FRAP和ABTS+·体系抗氧化能力变化无规律，这也证明在基于电子转移的抗氧化体系藻蓝蛋白的蛋白部分起主要作用。