青虾4个性别相关基因的功能及相互作用研究

Macrobrachium nipponense is an important freshwater species for aquaculture in China. Due to the huge growth differences between male and female and the serious problem of multi-generations coexisting in a pond, the monosex culture would be highly valuable for M. nipponense. However, the mechanism of sex-determination remains unclear and therefore restricted the development of its sex-controlling breeding techniques. Based on last NSFC project having screened a series of sex-determination related genes in M. nipponense, this project aims to clarify the functions of sex-lethal (Sxl) and transformer-2 (Tra2) as the homologues of sex-determination genes in Drosophila melanogaster by RNA interference and tissue section, and to determine whether there is a similar sex-determination mechanism in M. nipponense; to identify the functions of candidate novel genes of slow-tonic S2 tropomyosin (Sst) and slow tropomyosin isoform (Sti), which are highly expressed genes in androgenic gland playing crucial roles in sexual differentiation. Meanwhile, through RNA interference, gene expression analysis, in situ hybridization and immunohistochemistry, this project also tries to determine whether exists interaction between the above four genes and locate the tissues (cell) for their expression. This project would improve the understanding on sex-determination mechanism in M. nipponense and provide basic information for its sex control breeding.

青虾是我国重要的淡水养殖品种，由于雌雄生长差异显著以及雌雄混合养殖存在严重的多代同塘问题，其单性养殖意义重大，应用前景诱人，但青虾性别决定及调控机制不清制约了性别控制育种的开展。本项目拟在前一个国家基金项目筛选了系列青虾性别决定相关基因的基础上，挑选4个重要基因进行研究。采用RNA干扰、组织切片等技术，研究与果蝇性别决定关键基因同源的青虾Sxl、Tra2基因之功能，以确定青虾是否存在类似的性别决定机制；研究青虾性别决定关键器官“促雄腺”高丰度表达基因(其它组织不表达或微量表达) Sst、Sti的功能，以挖掘新的性别调控基因；综合运用RNA干扰、基因表达分析、原位杂交、免疫组化等方法，确定4个基因之间是否存在调控关系并定位其表达的组织（细胞）。项目实施将推动青虾性别决定及调控机制的研究，并为青虾性控育种提供指导。

通过RNAi技术在青虾成体和发育过程分别对Sex-lethal(sxl)、Transformer-2(tra2) 、Slow-tonic S2 tropomyosin (sst)、Slow tropomyosin isoform (sti)进行干扰，跟踪观察促雄腺、性腺、副性征、外观形态等发育情况及雌雄比例，结果表明，MnSxl和MnTra-2基因在性腺分化和发育过程中起重要作用，而MnSst和MnSti基因在促雄腺形态维持方面起重要作用；通过原位杂交技术分别对sxl、tra2、sst、sti基因相应mRNA进行成体促雄腺、精巢以及卵巢不同发育时期组织学定位研究，结果表明，MnSxl基因和MnTra-2α基因mRNA在所有卵母细胞中均可见，包括卵黄颗粒、核、和细胞质膜，而MnSxl基因和MnTra-2α基因mRNA只在精巢精原细胞中可观察到信号；青虾SST基因与STI基因都在输精管的壶腹部末端（EB）肌肉层有强信号显示；在青虾成体和发育过程中通过RNAi技术以及qPCR定量表达分析技术明确了MnSxl、MnTra2、MnDsx、MnIAG等基因间的相互调控关系，结果表明，MnSxl、 MnDsx和MnTra-2具有相互正调控关系，而与MnIAG的调控关系均为负调控；通过RNAi技术在青虾成体和发育过程中对MnSst和MnSti基因进行功能研究，RNAi后，实验虾出现大量死亡现象，通过组织学切片对死亡实验虾的肝胰腺、腮等组织进行组织学观察，结果表明，实验虾死亡为腮损伤引起的；通过转录组比较分析技术对sst和sti基因RNAi后的致死机理进行研究，结果表明，过氧化物酶体、细胞凋亡、溶酶体及谷胱甘肽代谢等信号通路在实验虾腮损伤免疫应答机制中起重要的作用；通过三代测序以及二代转录组比较分析技术对性别分化关键基因进行筛选，结果表明，骨骼肌蛋白6、血蓝蛋白亚基1、淀粉酶等12个基因在青虾性别分化过程中起重要作用；通过对7种常用的管家基因在日本沼虾中进行qPCR时空表达研究，开展适合日本沼虾性别相关基因功能研究的内参基因筛选工作，结果表明，EIF5A（真核翻译起始因子5A）可准确对日本沼虾性别相关基因功能进行研究；通过RACE克隆、qPCR、原位杂交以及RNAi等技术对DMRT11E以及SoxE等性别相关基因进行功能分析，结果表明，这些基因在青虾性腺发育和分化过程中起重要的作用。