青虾促雄腺性别调控基因的筛选、克隆及功能研究

The androgenic gland(AG) is a male-specific endocrine gland of crustacean and plays a key role in sex controlling. In this study, Digital Gene Expression Profiling (DGE) technique is applied to analyse gene expression of AG using male individual without AG as control in Macrobrachium nipponense. AG-specific expressed sequences are screened out by comparison between AG and control. Full-length cDNAs are cloned and their expressin during development are analysed in order to find sex-related genes by correlation analysis between gene expression and sex differentiation. The functions of sex-related genes are studied by RNA interference (RNAi) technique,especially for key genes of sex controlling. This project will make up the deficiency of research on genetic controlling of sex in Macrobrachium nipponense and promote research of genetic breeding by sex-control in freshwater prawns and crabs.

;促雄腺是甲壳动物雄体特有的内分泌腺,在性别分化、发育和维持中起关键作用。本项目拟以青虾促雄腺为研究对象，以切除促雄腺的雄性青虾为对照，采用基于高通量测序的数字基因表达谱技术（DGE）分析基因表达谱，通过比对筛选出"促雄腺特异表达序列"；克隆"促雄腺特异表达序列"对应基因的全长cDNA序列，并采用实时荧光定量PCR技术分析"促雄腺特异表达基因"在青虾发育过程的时空表达变化，阐明其时空表达模式，通过基因表达与性别分化的关联分析，筛选出促雄腺性别调控相关基因；采用RNA干扰（RNAi）技术沉默促雄腺性别调控相关基因（尤其是性别调控的"关键基因"），确定其在调控青虾性别分化、发育与维持过程中的功能。本研究将填补青虾性别遗传调控研究的空白，为青虾性别控制育种奠定基础，并将促进淡水虾蟹性别控制育种的研究。

青虾是我国重要的淡水养殖种类，其雌雄生长差异显著，在收获季节雄虾的个体规格为雌虾的2-2.5倍，因此青虾单性养殖前景广阔。促雄腺是雄性甲壳动物特有的内分泌腺，与性别分化、雄性发育及雄性特征维持有关，在甲壳类性别调控中发挥着关键作用。青虾属于甲壳动物，为此本项目拟以青虾促雄腺为材料，采用高通量测序技术构建促雄腺转录组；基于功能注释筛选与其他物种性别调控基因同源的基因，同时基于表达量的差异筛选青虾性别调控新基因；对筛选得到的性别调控相关基因进行克隆及时空表达分析，进一步确定其与性别调控的相关性。.本项目构建了青虾促雄腺转录组，共拼接得到57,619个unique sequences，平均长度为1,244.19 bp，均已登录到www.ffrc.cn/gene/list.asp。基于功能注释，筛选得到47个性别调控同源基因；基于表达量的差异，筛选得到40个青虾性别调控候选新基因，其中许多是在甲壳类中的首次报道。从转录组序列中获得12,437个SSR标记和65,535个SNP标记；对部分SSR标记进行筛选，获得14个高度多态的SSR标记，PIC值在0.613到0.899之间，为亲缘关系鉴定等提供了有效的分子工具。.对性别调控同源基因Transformer-2、Sex-lethal、Extra sex combs和chitinases进行cDNA克隆，并进行时空表达的定量分析，结果表明其功能与青虾性别调控相关。同时，在相关功能基因中开展了SNP筛选工作。.挑选表达量差异最显著的slow-tonic S2 tropomyosin (Sst)、Slow tropomyosin isoformv (Sti)、B-glucosidase 23 (B-23)等3个促雄腺性别调控候选新基因，进行cDNA克隆及组织表达验证。荧光定量分析表明，Sst和Sti在促雄腺中的表达量最高且与其他组织差异极显著（P<0.01），表明其功能与青虾性别调控有关；而B-23在肝脏中的表达量最高，其功能可能与性别调控无关。.项目研究结果填补了青虾性别遗传调控研究的空白，为青虾性别调控机制研究和性别控制育种积累了数据，并可为淡水虾蟹性别调控研究提供借鉴。