TBXAS1基因导致遗传性多发性骨软骨瘤的致病机制研究

Hereditary multiple exostoses (HME) is regarded as a benign tumor with the basic pathological changes of abnormal growths of long bone cartilaginous capped (osteochondroma), part of patients may be malignant transformation of chondrosarcoma. Most of HME were caused by gene mutations in EXT1 and EXT2, but there still about 15% of the patients are not linked to these known genes. Based on the Whole exome sequencing, we successfully identified a new disease-causing candidate gene, TBXAS1, in three HME famlies without any mutations in EXT1/EXT2. TBXAS1 gene expresses in osteoblast, osteoclast as well as chondrocyte, and it participate in the chondrogenesis, but its specific function is not clear. The role of TBXAS1 gene in chondrocytes proliferation and differentiation as well as downstream signaling pathways will be evaluated by confocal technology, Western blot, immunofluorescence, Co-IP, and ChIP methods, thereby to investigate the role of TBXAS1 gene in the occurrence and development of HME and its molecular regulation mechanism. This study will provide a fundament for revealing the pathogenesis of HME from TBXAS1 this new viewpoint, and offer experimental evidence for new therapeutic targets in HME.

遗传性多发性骨软骨瘤（HME）是一种较常见的良性骨肿瘤，多呈常染色体显性方式遗传，部分患者可恶变为软骨肉瘤。目前已知大部分的HME是由EXT1和EXT2基因突变引起的，但仍有约15%的患者无法明确致病基因。课题组前期利用全外显子组测序技术，成功在三个EXT1/EXT2突变阴性的HME家系中鉴定到了新的候选致病基因“血栓素A合成酶”（TBXAS1）。TBXAS1基因表达于成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞，参与软骨的发育过程，但其具体功能不清。本项目拟运用免疫荧光、激光共聚焦、Western blot、Co-IP及ChIP等技术方法，研究TBXAS1基因在软骨细胞增殖/分化中的具体作用及其对下游信号通路的调控，从而初步阐明TBXAS1基因在HME发生发展中的作用及分子调控机制。本研究将从TBXAS1这个新视点为进一步揭示HME的致病机制奠定基础，为寻求新的治疗靶点提供实验依据。

遗传性多发性骨软骨瘤（hereditary multiple exostoses, HME）又称为遗传性多发性外生骨疣，是一种较常见的良性骨肿瘤，但亦有5％的患者可恶变为软骨肉瘤。本项目前期在三个HME家系（EXT1/EXT2检测阴性）中，利用全外显子组测序技术成功鉴定到血栓烷A合成酶（thromboxane A synthase 1, TBXAS1）基因的变异（c.826C>T,p.R276W；c.859C>T, p.R287*；c.1176delC,p.Y393fs*5）。经遗传生物信息学分析，确认TBXAS1是HME的候选致病基因。本项目通过构建TBXAS1野生型和突变型表达载体，进行体外功能研究，分析TBXAS1突变对TBXAS1表达和酶活性的影响；通过ITS诱导分化建立ATDC5细胞软骨分化模型以及斑马鱼Tbxas1低表达模型，研究TBXAS1对软骨细胞增殖和分化的影响。研究发现p. R276W不影响蛋白表达但显著降低TBXAS1的酶活性，证实TBXAS1通过功能丧失（loss of function, LOF）方式致病。在ITS诱导ATDC5细胞分化的不同时间点Tbxas1表达持续下降，提示TBXAS1的缺乏可能促进软骨细胞的分化。进一步敲低Tbxas1后发现软骨细胞的增殖受到抑制，但其分化程度进一步增加；斑马鱼中敲低Tbxas1导致头部因软骨细胞体积变大且呈异常的团状变大导致的软骨形态异常；这些结果表明TBXAS1缺乏引起的软骨细胞过度分化成熟并肥大化是HME发生的病理基础。通过进一步检测RANK-RANKL-OPG信号通路成员表达水平发现减少Tbxas1的表达可促进Opg水平增加，同时降低RANK/RANKL的表达水平。该研究证实TBXAS1突变导致HME的分子基础为OPG/RANK-RANKL比例失衡，导致软骨细胞增殖/分化调控失衡。该研究阐明了TBXAS1作为HME的新致病基因的分子致病机制，将进一步提高HME的分子诊断水平。此外，该研究还表明作用于OPG-RANK-RANKL信号通路药物在TBXAS1突变导致的HME治疗中具有潜在应用价值。