SLC20A2调控软骨细胞磷代谢在遗传性多发性骨软骨瘤中的致病作用及机制

Hereditary multiple exostoses(HME) is a common benign bone lesion leading to local deformation, pain, and dysfunction, or even malignant transformation. Exostosin-1(EXT-1) and EXT-2 gene mutations are the main known causes of HME. However, the causes of many HME patients are still unclear. In our recent studies, we confirmed 5 families who had no EXT-1 or EXT-2 mutation, and found SLC20A2 gene mutation existing in 3 families. SLC20A2 is a transmembrane protein of a type III Na+/Pi cotransporter(pit-2), which regulates the metabolism of phosphate in a cell. It is known that phosphate plays an important role in the regulation of chondrocyte proliferation and differentiation. HME often manifests as abnormal proliferation and differentiation of chondrocytes. Thus, we deduce that SLC20A2 mutation may cause disturbances of phosphorus metabolism in chondrocytes, subsequently give rise to abnormal proliferation and differentiation of the chondrocytes, finally leading to HME. In this study, we plan to establish models of chondrocyte line and mice with SLC20A2 mutation, then investigate the changes of expression and function of this variant gene, focusing on the change of phosphate metabolism, proliferation and differentiation of chondrocytes. We aim to demonstrate that SLC20A2 is a new candidate gene of HME. These will provide theory evidence for the treatment of HME in future.

遗传性多发性骨软骨瘤（HME)是常染色体显性遗传的良性骨病变，可致患者局部畸形、疼痛和功能障碍，甚至恶变。既往研究表明EXT-1和EXT-2基因变异是该病的主要致病原因，但尚有部分患者的致病原因不清楚。我们近期在5个无EXT-1和EXT-2基因突变的HME家系中，发现3个家系同时存在SLC20A2基因相同突变。SLC20A2系III型钠-磷协调转运子，主要参与细胞磷代谢，而磷代谢在软骨细胞增殖和分化中发挥重要作用。鉴于HME主要表现为软骨细胞增殖和分化障碍，我们的科学假说是：该SLC20A2基因突变通过影响软骨细胞磷代谢，进而引起软骨细胞增殖和分化障碍，并最终产生HME。本课题将建立SLC20A2基因点突变的软骨细胞系和小鼠模型，对该基因变异在表达水平、功能变化，特别是在磷代谢以及软骨细胞增殖和分化等方面进行研究，拟证明SLC20A2是HME一新的致病基因，为治疗该类疾病提供理论依据。

遗传性多发性骨软骨瘤（Hereditary Multiple Exostoses，HME）是一种常见的常染色体显性遗传病。该病可以引起肢体局部外观异常、疼痛、关节活动障碍、肢体畸形等症状。目前，HME的发病机制还不清楚。已经有不少研究认为HME的发病主要与肿瘤抑制基因-1（Exostosin-1，EXT-1）和EXT-2突变有关。然而，非EXT-1和EXT-2基因突变导致的HME患者也广泛存在。我们通过对非EXT基因突变的HME家系研究发现，SLC20A2基因突变（C1849T）也可能是导致HME发生的原因之一。我们首先构建了SLC20A2基因突变（C1849T）的软骨细胞系模型（ATDC5）。主要结果如下：1）qPCR和Western blot检测显示野生型和突变型ATDC5细胞的SLC20A2的表达水平无明显差异。2）孔雀绿磷酸盐试剂盒检测显示，SLC20A2突变导致软骨细胞内磷的摄取明显降低；3）CCK-8试剂盒检测结果显示SLC20A2突变组软骨细胞增殖率明显增加。qPCR和Western blot检测显示突变组细胞的软骨增殖指标Acan、 COL2A1、和SOX9等表达水平显著升高；阿利辛蓝染色显示突变组细胞的糖胺聚糖显著多于对照组；4）SLC20A2突变组ATDC5细胞的软骨分化指标Runx2、COL10A1、MMP13等的表达水平显著降低，茜素红染色提示突变组细胞的钙沉积明显少于对照组；5）qPCR和Western blot检测显示SLC20A2突变组的Ihh和PTHrP的表达水平显著升高。除了软骨细胞系以外，我们还构建了SLC20A2基因突变的大鼠模型。通过比较突变型和野生型大鼠的全身骨骼X线，两组大鼠骨骼未见明显差异，突变组大鼠骨骼干骺端未见明显骨软骨瘤形成。qPCR和Western blot检测显示，两组大鼠的软骨、肌肉、血液中SLC20A2的表达水平无明显差异。孔雀绿磷酸盐试剂盒检测显示两组大鼠细胞的磷摄取无明显差异。综上，本研究结果显示在体外细胞实验中SLC20A2基因突变不会改变细胞内SLC20A2的表达水平，但可引起细胞内磷的摄取降低。同时，该突变可促进软骨细胞的增殖并抑制软骨细胞分化。该作用可能通过激活Ihh/PTHrP信号通路导致。然而，在动物体内其作用还有待进一步研究。该结果为进一步阐明HME的发病机制具有一定参考意义。