成分明确的多肽修饰人多能干细胞体外培养微环境构建及其多能性维持的分子机制研究

Replacement of Matrigel in the cultivation of human pluripotent stem cells which include human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and human embryonic stem cells (hESCs) has been a hot area of research. For the key problems of the in vitro culture of hiPSCs/hESCs, cell adhesion and the maintenance of pluripotency, as well as the security of clinical application in the use of Matrigel, we build a kind of artificial niche named functional peptide modified microenvironment. We design and synthetize functional peptides primarily, then graft carboxymethyl chitosan on the surface of polystyrene which was treated by poly-dopamine. Finally these materials are modified by functional peptides. The whole system is a clear constituent and functional microenvironment. The effect of modification style of functional peptides to the cell adhesion and maintenance of the pluripotency of hiPSCs/hESCs will be studied. The influence and regulation of functional peptide modified microenvironment compared with Matrigel will also be investigated. Furthermore, transcriptomic and quantitative proteomic strategies are introduced to study the molecular mechanism of cell adhesion and pluripotency maintenance. This subject intend to established a new microenvironment in replace of Matrigel for hiPSCs/hESCs cultivation and reveal the regulatory network correlated with the function of human pluripotent stem cells. It will provide experiment evidence for further research on three-dimensional microenvironment for hiPSCs/hESCs cultures.

建立成分明确、替代Matrigel包被的体外培养微环境是目前人多能干细胞(hiPSCs/hESCs)研究领域的热点。针对hiPSCs/hESCs体外培养中关键环节（细胞贴壁生长）及核心问题（细胞长期培养中干性维持及临床应用潜在安全性），本课题首先设计、合成功能多肽，然后在聚多巴胺处理的聚苯乙烯培养板表面接枝羧甲基壳聚糖，再用特定功能多肽修饰羧甲基壳聚糖表面，构建成分明确、功能化的人多能干细胞培养微环境--功能多肽修饰微环境。研究功能多肽在羧甲基壳聚糖表面的接枝方式对干细胞贴壁性能的影响；研究构建的功能多肽修饰微环境对干细胞贴壁生长、干性维持的作用规律及调控方式；采用转录组学、定量蛋白质组学重点研究微环境对干性维持影响的分子机制。建立一种新型的、成分明确的培养hiPSCs/hESCs的微环境；揭示微环境对人多能干细胞贴壁性能、干性维持作用影响的分子机制，为构建理想的三维微环境提供实验依据。

建立成分明确、 替代 Matrigel 包被的体外培养微环境是目前人多能干细胞(hiPSCs/hESCs)研究领域的热点。针对 hiPSCs/hESCs 体外培养中关键环节（ 细胞贴壁生长）.及核心问题（ 细胞长期培养中干性维持及临床应用潜在安全性），本课题在聚多巴胺处理的聚苯乙烯培养板表面接枝羧甲基壳聚糖，再用VN功能多肽修饰羧甲基壳聚糖表面，开发了一种人工合成的PDA-CMC-VN修饰表面。实验证实该表面能够在成分明确条件下，支持人体细胞重编程，多种hiPSCs的长期自我更新和定向分化。具体而言，采用EDTA消化方法和添加Y-27632，hiPSCs在PDA-CMC-VN表面培养四天的细胞量与Matrigel对照相近。转录组学分析发现，对于在PDA-CMC-VN和Matrigel表面贴壁24h的hESCs及hiPSCs，细胞粘附相关基因和多能性相关基因在它们中的表达量相近。在PDA-CMC-VN表面和成分明确条件下，成功将人尿液细胞和人脐带血细胞重编程为hiPSCs。而且，PDA-CMC-VN表面可支持多种hESCs及hiPSCs的长期自我更新。然后，证实PDA-CMC-VN表面培养的hESCs及hiPSCs，可以在成分明确条件下分化为神经元细胞和心肌样细胞。最后，发现PDA-CMC-VN修饰层可扩展至多种基体表面，用于hiPSCs的贴壁和增殖。本项目开发的细胞培养板表面修饰方法，具有使用生物相容性原材料，制备过程简单，容易实现工业化生产，成本低，支持体细胞重编程和人诱导多能干细胞长期扩增和定向分化性能优越，能够在E8培养基中支持人诱导多能干细胞干性维持等优点，具备十分重大的科学研究价值和产业化应用前景，推动hiPSCs在细胞治疗和组织再生修复中的应用。