基于肝癌细胞外泌体关键基因/蛋白筛选的血清标志物及预警研究

Hepatoma carcinoma (HCC) is the first fatal malignant tumor in Guangxi province. On the basis of the previous Natural Science Foundation of China（NSFC），we further investgate the biomarkers specifically derived from hepatic carcinoma cells. This project cultures hepatoma cells and normal hepatocytes, employs relative quantitative proteomics to screen special proteins within hepatoma cells, select exosomes derived from hepatoma cells （X+Exos）by cytometry. Also, employing relative quantitative proteomics, transcriptome sequencing technology, and bioinformatics to analyze the main function of X+Exos, and determining the its key genes/proteins and screening the candidate serum biomarkers of HCC. Utilizing the epidemiological diagnostic test to detect the expressed levels of the candidate serum biomarkers in reserved serum of HCC, patients with hepatic cirrhosis, patients with chronic hepatitis B, and normal subjects. Moreover, matching the results with clinical cases to look for the sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of the candidate serum biomarkers and RBP4,NEK2 that come from previous selection. Besides, by adding AFP, to finally define the combined serum biomarker of HCC. Finally, exploiting diagnostic test study based on the prospective cohort from high risk population that have high incidence of HCC in Guangxi, to examine the effect of combined biomarker as a early warning. This researching result strives to provide new valuable biomarkers for prevention and control of HCC.

肝癌是广西第一位癌症杀手。在前国家自然科学基金项目研究基础上，进一步探讨肝癌细胞特异来源标志物问题，本项目拟通过培养肝癌细胞和正常肝细胞，相对定量蛋白组学技术，筛选肝癌细胞特异表达蛋白；分选特异性肝癌细胞来源外泌体（X+Exos），利用相对定量蛋白组学、转录组测序技术和生物信息学分析X+Exos主要功能，确定其关键基因/蛋白并从中筛选血清候选标志物；采用流行病学诊断试验研究方法，检测血清候选标志物在肝癌，肝硬化，慢性乙肝患者及正常对照人群血清中的表达水平，结合临床病例资料，分析血清候选标志物与前期筛选的RBP4、NEK2及AFP联合诊断肝癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，确立肝癌血清组合标志物；利用广西肝癌高发区高危人群队列，采用基于前瞻性队列的诊断性试验研究评价组合标志物的在肝癌高危人群中的预警作用。研究结果力争为肝癌防制提供新的有价值的标志物。

肝癌是广西第一位癌症杀手。本项目开展以下研究：.1.肝癌细胞外泌体蛋白组学和转录组学分析。改良超速离心法有效分离出高纯度细胞外泌体，透射电镜、Western blot及 Nanosight检测确认外泌体；相对定量蛋白组学和转录组测序分别筛选出肝癌细胞外泌体共同表达的蛋白836和通路34条，及8,572条差异表达的lncRNA。.2. lnc85通过抑制mir-324-5p的表达调节其下游基因，从而调控肝癌细胞的增殖。lnc85具有作为HCC血清标志物的潜能，可与其他标志物联合提高肝癌诊断的灵敏度。.3. miR-224作为肝癌的早期生物标志物，与AFP联合诊断早期HCC时，SE和SP分别升高至0.882和0.808，miR-125b的低表达水平和miR-224的高表达水平与肝癌不良预后水平之间存在联系。.4.肝癌细胞/外泌体中VASN高表达与预后不良显著相关，体内外实验显示敲除VASN和VASN单抗均可抑制肝癌细胞的增殖和迁移，VASN与HSPA5结合，通过磷酸化JAK/STAT通路中的STAT3，正向调控MMP2和CCND1的表达而促进肝癌细胞的增殖和迁移。.5.对广西地区761例HCC病人、CHB和HC的多层次的病例对照研究表明，以HC和CHB为对照时，AFP和RBP4联合诊断肝癌时AUC为0.919（95%CI：0.898~ 0.940），RPB4是有前途的HCC血清标志物；同时RBP4低表达可作为肝癌预后的指标。.6. 制备人NEk2，RBP4，VASN单克隆抗体。通过构建了pET30a(+)-目的基因的原核表达质粒，表达和纯化重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠，制备多克隆和单克隆抗体，可用于免疫细胞化学染色和抑制肝癌细胞增殖。.7. 构建RBP4蛋白ELISA检测试剂盒，已取得产品注册检测合格证，正在申报体外诊断试剂批文，实现研究成果转化。