结核分枝杆菌热休克蛋白65-肿瘤细胞裂解物抗肺癌疫苗的改进研究

Anti-tumor vaccine is a focus point of tumor immunology in recently years.Amongthem, tumor cell lysate (TCL) vaccine has better anti-tumor effect. However,suppressiverole on immunocytes is the major problem of TCL. In this study,we will makea improve on mycobacterial heat shock protein 65-tumor cell lysate (MHSP65-TCL) we developed before.At first, we will detect immunosuppressive effect of TCL to T lymphocytes, NK cell, MΦ and DC. Then, trying to get rid of HA,FasL,TGFβ and B7-H1 from TCL using affinity chromatography、Immunoprecipitation、CRISPR- Cas 9 gene editing system to enhance MHSP65-TCL’s activate effect on immunocells..Follow that, the anti-lung cancer role of improved TCL will be estimated by experiments in vitro and vivo. These should uncover the dual effect of TCL on immunocytes. Moreover, based on the finding that TCL could upregulat CD69 expression in our past research, we will conbine MHSP65-TCL with anti-CD69 mAb,which will enhance anti-lung cancer immunity of MHSP65-TCL further by inhibiting CD69 signal.tansduction, reducing apoptosis of immnocytes and emergence of T regulation cells.Therefore,a new method of anti-tumor immunotherapy will be developed.

抗肿瘤疫苗是近年来肿瘤免疫学研究的热点。其中，肿瘤细胞裂解物（TCL）疫苗已取得了良好的肿瘤治疗效果，但也存在抑制免疫细胞活性的问题。本研究拟对既往构建成功的结核分枝杆菌热休克蛋白65-肿瘤细胞裂解物（MHSP65-TCL）抗肺癌疫苗进行改良。首先，检测TCL籍透明质酸、凋亡诱导因子FasL、TGFβ、B7-H1对小鼠T、NK、MΦ、DC等免疫细胞的抑制作用；其次，借助层析、免疫沉淀、CRISPR-Cas9 基因编辑系统从TCL中将相应成分去除；进而，通过体内外实验评估改良后的MHSP65-TCL疫苗的抗肺癌效果，揭示TCL的双重免疫反应性。同时，基于过去研究所发现的CD69上调现象，拟联合使用CD69单抗与MHSP65-TCL，通过抑制CD69信号转导通路降低免疫细胞凋亡和调节性T细胞的产生，以进一步提高MHSP65-TCL疫苗的抗肺癌效力。由此，建立一种肿瘤免疫治疗的新方法。

结核分枝杆菌热休克蛋白65-肿瘤细胞裂解物（MHSP65-TCL）是我们既往构建的一种抗肺癌疫苗，这种疫苗中最主要的抗肺癌物质是肿瘤细胞裂解物（TCL）。不过，TCL成分复杂，其中存在的免疫抑制物质会抑制免疫细胞。本研究拟找到TCL中的免疫抑制物，并在此基础之上对MHSP65-TCL抗肺癌疫苗进行改良。首先，检测TCL中籍透明质酸、凋亡诱导因子FasL、TGFβ、B7-H1（又称PDL-1、CD274）对小鼠T、NK、MΦ、DC等免疫细胞的抑制作用；其次，借助层析、免疫沉淀或RNA干扰技术从TCL中将相应成分去除；进而，通过体内外实验评估改良后的MHSP65-TCL疫苗的抗肺癌效果。. 通过上述研究我们发现：TCL中存在透明质酸、FasL、TGFβ、B7-H1等免疫抑制物，这些物质使得TCL在活化免疫细胞的同时，也会产生抑制免疫细胞活性及诱导免疫细胞凋亡的作用。接下来，我们尝试使用亲和层析、免疫沉淀或RNA干扰技术从TCL中去除透明质酸、FasL及B7-H1。其中，免疫沉淀或RNA干扰去除TCL中免疫抑制蛋白技术上可行。但实际操作过程中，只有利用RNA干扰技术从TCL中去除单个蛋白FasL获得成功。籍此改进的TCL，我们构建了MHSP65-（FasL-/TCL)。最终的体外细胞实验和体内抑瘤实验均显示MHSP65-（FasL-/TCL)比MHSP65-（FasL+/TCL)具有更好的抗肺癌作用。. 本研究证明了TCL中存在免疫抑制物，TCL因此具有激活和抑制免疫细胞的双重反应性。通过RNA干扰或免疫沉淀的方式，TCL中的免疫抑制物质可以被去除。改进后的TCL能更好的活化免疫细胞，并增强MHSP65-TCL疫苗的抗肺癌效果。通过去除TCL中的免疫抑制物提高其免疫活性的研究思路及技术方法，对各类基于TCL的抗肿瘤疫苗的构建都具有应用价值。