缩泉丸对糖尿病膀胱神经传导功能异常的修复作用及其机制研究

Diabetic Cystopathy (DCP) is one of most common complications in diabetes. Suo Quanwan(SQW), as a main prescription of TCM therapy “nourishing kidney and reducing urination”, regulates the expression of neurotransmitters of bladder smooth muscle. Based on the Clinical researches, SWQ has significant effect on the treatment of DCP. By the workshop with Harvard Medical School, it is proved that Myosin Va plays an important role in the presynaptic release of neurotransmitters in bladder neurons. So we proposed the hypothesis that the mechanism of SQW in the treatment of DCP is related to its regulation of neurotransmitter release via myosin Va. By means of CRISPR-Cas9 gene editing technique, we will investigate (1) the abnormality of neurotransmission in DCP animal and potential signaling pathway regulated via Myosin Va. (2) the influence of SQW on such abnormal neurotransmission and regulation on the transcription and expression of the gene of Myosin Va. Our aim is to eluciates the underlying mechanism of SQW in the treatment of DCP, which could enrich our knowledge on the theory of Kidney improvement in TCM.

糖尿病膀胱（DCP）是一种常见的糖尿病并发症。在前期研究工作中发现，补肾缩尿的代表方缩泉丸通过调节膀胱平滑肌上相关神经受体的表达从而调节平滑肌运动，临床和预实验研究中均证明缩泉丸对DCP有治疗作用。我们与哈佛大学合作的前期研究中发现：肌球蛋白Myosin Va 在膀胱神经元突触递质释放中起重要作用，课题组提出“缩泉丸通过调控Myosin Ⅴa参与运动神经元递质释放、调节膀胱神经传导功能，发挥治疗DCP的作用。”的假说。本项目利用整体观察比较和CRISPR-Cas9基因敲除等最新技术方法，从整体、组织、细胞和分子水平系统探讨：（1）DCP 膀胱神经传导的异常及Myosin Va调节膀胱运动神经传导的分子信号通路机制;（2）缩泉丸对DCP模型动物膀胱神经传导的影响及其对Myosin Va 的基因转录与蛋白表达的调控作用，目的是阐明缩泉丸治疗DCP 的分子机制，丰富中医补肾缩尿理论的内涵。

在糖尿病膀胱（DCP）发病中，膀胱神经传导以及膀胱神经元的递质转运与释放仍不十分清楚。本研究建立多种DCP模型动物，考察DCP模型动物神经传导的改变以及Myosin Va在DCP模型膀胱神经传导中的作用；研究缩泉丸对DCP模型动物膀胱神经元Myosin Va的靶向调节机制。.结果：.1.建立三种不同的DCP模型，动态观察造模后动物的一般状态、血糖水平、糖耐量、排尿活动、膀胱结构与功能的变化，建立稳定可靠的DCP模型。.2.DCP模型膀胱平滑肌神经传导异常的研究：DCP模型对EFS、α, β-MeATP、卡巴胆碱（CCh）和电场刺激（EFS）、KCl诱发的逼尿肌收缩反应增强。.3.Myosin Va在DCP神经传导异常中的作用：DCP模型膀胱中Myosin Va的表达水平升高，且Myosin Va与LC8、SLC17A9的共定位增加；Myosin Va与ChAT、SP、VIP等神经递质的共定位水平发生改变。 Myosin Va的部分缺失不仅抑制了DBA小鼠的膀胱神经传导，也在一定程度上影响钾离子通道的功能。.4.缩泉丸对DCP模型动物膀胱神经元Myosin Va的调节作用：缩泉丸能改善DCP模型动物的膀胱结构和排尿活动，对膀胱平滑肌自主收缩有抑制作用，还能抑制KCl、卡巴胆碱（CCh）和电场刺激（EFS）所致平滑肌收缩。缩泉丸下调DCP模型动物膀胱Myosin Va、SLC17A9、LC8表达水平。.5.缩泉丸对DCP 模型动物膀胱神经元Myosin Ⅴa靶向调节的机制研究：缩泉丸可下调DCP模型动物膀胱Myosin Va与ChAT、SP、LC8、SLC17A9的共定位水平。基因功能验证中，缩泉丸对神经递质释放相关蛋白LC8、SLC17A9的调控依赖于对Myosin Va的调节；Myosin Va SiRNA能降低Myosin Va蛋白及相关下游蛋白水平。Myosin Va 过表达慢病毒载体转染膀胱原代神经元后，Myosin Va蛋白及相关蛋白LC8水平上调。以上研究表明，缩泉丸依赖于Myosin Va的精细调节，通过修复膀胱神经传导异常，调控DCP模型动物膀胱神经丛的神经稳态，从而达到改善膀胱过度活动的治疗作用，科学诠释缩泉丸治疗DCP的分子机制，丰富中医补肾缩尿理论的内涵。