利用诱导性多能干细胞技术建立绵羊的多能干细胞系

利用动物胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）系可生产克隆动物及转基因动物。对保留珍贵物种、较高效率地制造有特殊医药营养和生物学用途的高质量,高存活率的转基因动物在目前有着不可替代的作用。对于历史上难以建立ESC的物种，如猪，羊等，iPS（induced pluripotent stem cell）技术无疑提供了一种替代方案。利用iPS技术生成的动物iPS细胞不仅具有ESC形态、可无限增殖、具三胚层发育潜能，而且可获得生殖系嵌合的动物。iPS技术已在小鼠，人，猕猴，大鼠几个物种上相继尝试成功。本项目拟利用基于可诱导慢病毒系统的iPS技术诱导生成绵羊的iPS细胞。绵羊iPS细胞不仅能够为评估绵羊ESC的特征提供标准，并且可诱导的慢病毒载体系统还有助于揭示绵羊ESC维持全能性的机理。绵羊iPS细胞还可替代难以获得的绵羊ESC，用于生产基因定点修饰的转基因绵羊。

本课题计划利用基于可诱导慢病毒系统的iPS技术诱导生成绵羊的iPS细胞系。按照课题计划，我们以可诱导慢病毒系统（Tet－on系统）为载体，分别介导Oct4、Sox2、c-Myc，Klf4、Nanog、Lin28、Sv40 large T、hTert 8种转录因子的表达，进而包装病毒，将病毒的“Cocktail”共转染绵羊成纤维细胞及骨髓间充质干细胞，建立了绵羊的iPS细胞。实验结果表明：我们建立的绵羊iPS细胞具有类似于多能干细胞的若干特性：该绵羊iPS细胞表现为高核质比、克隆扁平、边缘光滑；克隆呈碱性磷酸酶阳性；SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81、Rex1、E-Cadherin阳性；SSEA-3、SSES-4阴性；长期传代仍能够保持正常的核型；具有体外、体内分别形成含三胚层结构的拟胚体及畸胎瘤的能力。该成果发表在《Cell Research》杂志。我们建立的绵羊iPS细胞系不仅可以为尚未建系的绵羊胚胎干细胞的鉴定指标提供相应的依据，且基于可诱导系统建立的绵羊iPS细胞有望用于建立绵羊胚胎干细胞系的研究，并用于制备转基因绵羊及克隆绵羊。在本课题资助下，我们还利用相似的手段建立了山羊的iPS细胞系，成果发表在《Cell Research》杂志。此外，在本课题资助下，我们在《Stem Cell Review and Reports》上还发表了一篇人类胚胎干细胞定向分化相关的科研论文。累计发表SCI论文3篇，申请专利3项。