趋化因子受体CCR2/CX3CR1硫化修饰在慢性肾病促动脉粥样硬化发生发展中的作用及其机制研究

Patients with chronic kidney disease (CKD) are at high risk of cardiovasular disease (CVD). This increment is related to two main uremic toxins p-cresol sulfate (PCS) and indoxyl sulfate (IS), which resist to dialysis. In this study, we showed that PCS/IS possess pro-atherogenic effects in ApoE-/- mice. With mass spectrometry analysis, PCS/IS were shown to increase tyrosine sulfation in vivo, and chemokine receptor CCR2 and CX3CR1 were determined to be its potentical target proteins. In vitro, the tyrosine sulfation degree was elevated in condition of high PCS/IS level, and long-term treatment of PCS/IS induced expression of adhesion molecules and chemokines. Based on the correlations between tyrosine sulfation and atherosclerosis, this might be the underlying mechasiam of the pro-ahterogenic effects of PCS/IS. In the future study, we will confirm the atherogenic effects of PCS/IS in mouse model with high PCS/IS level and evaluate pathway mediation of PCS/IS effects using CCR2/CX3CR1-KO mouse. In addition, PCS/IS effects will be assessed in detail in endothelium cell, macrophage and vascular smooth muscle cell, with mechanism clarification.

慢性肾功能不全（CKD）患者心血管疾病（CVD）发生率高，这可能与体内不易去除的蛋白结合特性尿毒症毒素有关。我们发现其中主要毒素硫酸盐对甲酚（PCS）/硫酸吲哚酚（IS）体外短期刺激毒性不强，但长期在体干预具有显著促动脉粥样硬化作用。基于PCS/IS携带有大量硫酸根基团，进一步蛋白质谱发现PCS/IS具有促硫化修饰效应，趋化因子受体CCR2/CX3CR1为其主要修饰靶蛋白，这一机制可能与PCS/IS促动脉粥样硬化作用密切相关。后续将从体外实验探讨PCS/IS对内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞的作用，体内实验明确高PCS/IS水平致动脉粥样硬化效应及机制，共同阐明PCS/IS硫化修饰效应与促动脉粥样硬化的密切关联。最终在基因敲除水平验证CCR2/CX3CR1干预对PCS/IS致动脉粥样硬化的保护作用，该课题的完成将为临床改善CKD患者治疗方案提供可靠理论依据。

慢性肾功能不全（CKD）患者心血管疾病发生率高，主要体现在高动脉粥样硬化发生率，但原因未明。本项目研究发现CKD状态下血清中无机硫酸盐浓度升高，硫酸盐作为硫化反应底物促使CKD状态下硫化总蛋白水平增高，促硫化修饰关键酶TPST1、TPST2表达显著升高，提示硫化修饰效应在CKD状态下急剧放大。基于硫化修饰在动脉粥样硬化发生发展中的重要作用，我们设定该机制可能参与CKD相关动脉粥样硬化的发生发展。本项目通过建立5/6肾切除CKD小鼠模型，对主动脉根部动脉粥样硬化病变组织行免疫荧光共定位发现，CKD小鼠斑块中硫化抗体与过度浸润的巨噬细胞存在共定位，其外周血中有核细胞硫化蛋白比例亦显著增加。进一步的，本项目采用硫化抑制剂干预（rottlerin及suramin）、TPST基因敲除等手段，通过斑块油红染色、免疫组化、细胞迁移黏附实验等方法反复证实，硫化修饰可参与CKD相关动脉粥样硬化的发生发展，而通过抑制硫化修饰可起到对动脉粥样硬化的治疗作用。本项目最终收集终末期肾衰（ESRD）患者外周血单个核细胞（PBMCs），裂解提取总蛋白，运用免疫共沉淀、高效液相-质谱分析方法发现，趋化因子受体CCR2，CCR5为硫化修饰靶蛋白，该硫化修饰过程可能通过活化相关趋化因子，介导炎症细胞向动脉内膜迁移、黏附，最终导致CKD相关动脉粥样硬化的发生。本项目提示了一种全新的CKD促动脉粥样硬化致病作用机制，存在临床转化价值，项目的完成将为临床提高CKD相关动脉粥样硬化治疗效果提供可靠理论依据。