趋化因子受体CX3CR1在脑缺血损伤神经元上的表达及其作用和机制的研究

Preventing neuronal apoptosis is a main therapeutic method for ischemia stroke.Studies showed that CX3CR1 is expressed by neurons and affects the neuronal survival. However, the role and mechnism of neuronal CX3CR1 in ischemia stroke is unknown. Our preliminary experiment found that CX3CR1 deficiency decreased neuronal apoptosis in mice stroke model, and also prevented mitochondrial function. In vitro,CX3CR1 deficiency prevented neurons from apoptosis induced by glutamate. It is proven that the main mechanism of glutamate inducing apoptosis is to increase calcium influx. And calcium influx and mitochondria damage play an very important role in neuronal apoptosis after ischemia stroke Therefore, we hypothesize that the upregulation of neuronal CX3CR1-calcium influx-mitochondia dysfunction-neuronal apoptosis is a new mechanism of ischemia brain injury, and knocking out or blocking CX3CR1 expression will attenuate brain injury.In this study, we will induce mice middle cerebral artery occlusion (MCAO) model and neuronal ischemia model (oxygen and glucose deprivation,OGD)，using the techniques of gene transfection, intracelluar calcium imaging, immunofluorescence staining and mitochondrail function measuring et al., to prove the hypothesis from different levels of organ, cell and molecule. This will be a new therapeutic target for ischemia stroke.

减少神经元调亡是治疗缺血性脑中风的有效手段。研究表明，神经元表达趋化因子受体CX3CR1，且影响神经元的存活。但脑中风后，CX3CR1对神经元凋亡的调控和机制尚不清楚。我们的预实验结果发现：敲除CX3CR1可减少小鼠脑中风后神经元凋亡；CX3CR1缺失可减轻线粒体损伤；敲除CX3CR1可减少谷氨酸刺激后神经元的死亡。已证实谷氨酸诱导细胞死亡的主要机制是增加Ca2+内流，而Ca2+内流、线粒体损伤是中风后神经元凋亡的主要通路。据此，我们推测：CX3CR1表达上调，Ca2+内流增加，线粒体损伤，Caspase3激活是中风后神经元凋亡的新机制,而阻断CX3CR1表达可减轻中风后脑损伤。我们拟制备CX3CR1敲除鼠和野生鼠中风动物模型和缺血细胞模型，应用CX3CR1基因转染、细胞内钙显像、线粒体功能测定及免疫荧光等技术，从整体、细胞及分子水平证明我们的假说，为缺血性脑中风的治疗提供新思路和新靶点

背景:缺血性脑中风是危及国人健康和生命的主要杀手,减少神经元调亡是治疗缺血性脑中风的有效手段。研究表明，神经元表达趋化因子受体CX3CR1，且影响神经元的存活。但脑中风后，CX3CR1对神经元凋亡的调控和机制尚不清楚。.方向: 神经元CX3CR1表达上调，继而介导Ca2+内流增加，线粒体损伤，Caspase 3激活是脑缺血后神经元凋亡的新机制；同时，PI3K/Akt和MAPK信号通路也可能参与了CX3CR1对神经元凋亡的调节。.主要内容及重要结果: 发现缺血后急性期神经元CX3CR1表达上调, 且敲除CX3CR1后可减少梗塞面积并且改善临床症状, 进一步组织学检测发现敲除CX3CR1受体可减少脑缺血后神经元的凋亡。在此基础上，培养原代神经元细胞，检测了神经元上有CX3CR1表达，且缺氧缺糖后（OGD）表达上调，并对神经元的凋亡起调节作用。CX3CR1 调节缺血后神经元的凋亡主要机制是调节细胞内Ca2+的浓度，且CX3CR1可调节线粒体呼吸功能，敲除CX3CR1后可增加线粒体储备功能和氧利用能力。我们的结果也显示CX3CR1通过MAPK信号通路影响神经元的凋亡。.关键数据: 原代神经元缺氧后CX3CR1表达较对照组明显上调（p<0.05），同时小鼠中风后24小时WB和免疫荧光检测提示神经元CX3CR1表达上调（p<0.05）。脑缺血区Caspase-3/ CX3CR1/NeuN 都阳性的细胞，即表达CX3CR1且开始凋亡的神经元细胞较对照显著升高（p<0.01）。敲除CX3CR1 可减轻血流下降区域发展为脑梗塞的面积（96.7% vs. 71.9%, p<0.05 ）。敲除CX3CR1可减轻谷氨酸对神经元的毒性，且可显著降低钙离子内流（p < 0.01）。.科学意义：既往观点认为CX3CR1在中枢神经系统主要表达在小胶质细胞上，在神经元上表达很少或不表达。我们的研究首次发现：脑缺血后神经元上CX3CR1的表达是上调的，且在24小时达到顶峰，随后逐渐减少，72小时后接近缺血前。并且神经元上CX3CR1参与了脑缺血后神经元凋亡的调节，主要通过调节细胞内Ca2+内流，线粒体呼吸功能和MAPK信号通路来实现，可作为脑缺血后急性期治疗的靶点，具有较高的临床价值和科学意义。