阐释延伸因子EF4的分子机制和生理功能

Besides elongation factor G (EF-G) and elongation factor Tu (EF-Tu), elongation factor 4 (EF4) is the most conserved protein and presents in almost all bacteria. EF4 has similar protein domains and 3D structures as EF-G and EF-Tu. EF-G and EF-Tu are absolute essential protein factors for elongation cycles of translation. However, molecular mechanisms and physiological functions of EF4 in translation remain unknown..Recent studies showed that EF4 interacts with the ribosome in vivo and modulates protein expression level under certain conditions. Here, we propose to combine cutting-edge single molecule fluorescence techniques with newly emerging ribosome profiling method to shed lights on the mechanisms and functions of EF4. On one hand, we will combine total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope with four-color fluorescence resonance energy transfer (FRET) to carefully examine interaction between EF4 and the ribosome during translation and to obtain corresponding structural change and kinetic information at molecular level, including conformational changes of EF4, conformational changes of the ribosome induced by EF4 binding, and modulation between them. On the other hand, we will use ribosome profiling method to screen and locate where EF4 modulates translation in cell. By combining knowledge gained from two different methods, we will be able to reveal the molecular mechanisms and physiological functions of EF4 and elucidate how its molecular mechanisms lead to its functions at cellular level.

延伸因子EF4是细胞内最为保守的蛋白质之一，仅次于延伸因子EF-G和EF-Tu。EF4、EF-G和EF-Tu都有着类似的蛋白结构域和三维结构。EF-G和EF-Tu是翻译过程所绝对必需的辅助因子。但EF4参与翻译过程中的分子机制及其生理功能至今仍不清楚。.近期研究表明，EF4可与核糖体结合，并在某些条件下对蛋白表达水平起着一定的调控作用。在此，我们计划结合先进的单分子荧光技术和新兴的核糖体图谱技术来揭示EF4的机制和功能。一方面，利用基于全内反射荧光显微镜的四色荧光共振能量转移技术，从多个维度细致表征EF4与核糖体相互作用时的结构和动力学信息，包括：EF4自身构型变化、EF4诱导的核糖体构型变化、以及相互作用时两者之间的调控等。另一方面，利用核糖体图谱技术在细胞层面高通量的筛选EF4在翻译过程的功能位点。最后结合两个层面的认知，阐述EF4的分子机制和生理功能及其两者之间的联系。

延伸因子EF4是细胞内最为保守的蛋白之一，它与延伸因子EF-G和EF-Tu都有着类似的蛋白结构域和三维结构。但在分子水平，EF-G和EF-Tu都是翻译过程所必需的辅助因子，而EF4则不是。在细胞水平，EF-G或EF-Tu的敲除对大肠杆菌都是致死的，而敲除EF4的大肠杆菌在适宜环境下的生长速度和蛋白表达水平与野生型的大肠杆菌无异。研究表明，EF4可与核糖体结合，并对翻译过程起着一定的调控作用。但EF4的分子机制和生理功能至今仍不清楚。在本项目中，完成了有活性的荧光标记EF4的制备，并发展了新型的单分子荧光技术手段来捕捉EF4参与的动态生化过程，最终细致表征了分子水平上EF4与核糖体的相互作用以及对翻译过程的调控。在细胞水平上，筛选出使野生型和EF4敲除型的大肠杆菌出现显著生长速度差异的抗生素，并对此抗生素生长条件下的大肠杆菌进行了转录组和核糖体图谱的建库、测序和数据分析。通过这一系列工作，本项目揭示了EF4可以与核糖体的PRE-translocation和POST-translocation状态结合、减缓翻译速率、并主要通过阻碍酰胺化tRNA的进入将核糖体停滞在POST状态。以上现象从分子层面阐明了EF4可能的分子机制：EF4通过稳定并结合停滞在POST状态的核糖体，从而保护初生肽链不被水解；当外界压力消失时，POST状态的核糖体可以继续翻译过程；如果外界压力持续存在，那么POST状态的核糖体也可以被辅助蛋白识别进入回收途径。因此EF4是胁迫条件下核糖体和翻译过程的保护因子。此外，本项目还开发出新型的单分子荧光显微技术，为捕捉近生理条件的微摩尔每升浓度下、高时间分辨、长时间尺度的生物分子动态过程提供了重要的技术手段，并用以研究和揭示其它重要生物大分子机器的分子动态和机制。