翻译延伸因子42Sp50在罗非鱼卵子发生中的作用和机制研究

The study of oogenesis is always an important research area, since egg maturation is a prerequisite for the completion of reproduction. Oogenesis is a highly complex process, during which numerous proteins are synthesized in the ovary. eEF1A family members are crucial for protein bio-synthesis. 42Sp50 is an ovary-specific form of eEF1A, which is a very potential candidate gene to mediate ovary development. However, the impact of 42Sp50 on oogenesis has not been reported before. In our previous study, we established the 42Sp50 knockout line in Nile tilapia. Loss of 42Sp50 resulted in folliculogenesis arrest and suppression of steroidogenesis. In this study, in order to elucidate the function of the 42Sp50 on oogenesis in detail, we will perform proteomic and transcriptomic analysis to screen and identify the target genes of 42Sp50. Repressing the activities of 42Sp50 with in vivo and in vitro experiments will be performed to further determine the key target genes involved in folliculogenesis and steroidogenesis. Furthermore, transgenic experiments and exogenous estrogens treatment will be performed to rescue the ovary phenotype of the 42Sp50-/- XX fish. Our research will not only help to elucidate the role and molecular mechanism of eEF1A in the oogenesis in teleosts, but also provides a theoretical foundation for improving protocols for higher efficiency of egg production in aquaculture.

卵子发生是完成生殖的先决条件，因此，对卵子发生的调控机制研究是生物学研究热点之一。卵子发生过程高度复杂，需要众多蛋白质的参与。翻译延伸因子eEF1A家族对蛋白质的翻译不可或缺，42Sp50是eEF1A家族的特殊成员，它是卵巢特异的翻译延伸因子。申请人前期建立了罗非鱼42Sp50突变系，发现缺失42Sp50导致卵泡发育停滞于初级生长阶段，且卵巢类固醇生成受到抑制，表明42Sp50在卵子发生中具有重要作用。基于此，本研究拟通过蛋白质组和转录组测序分析等手段鉴定42Sp50的下游作用基因，结合抑制42Sp50功能活性的在体和离体研究，进一步确定导致卵巢表型的关键下游基因。同时，通过转基因过表达和雌激素处理回救卵巢表型，阐明42Sp50在卵子发生中的作用机制。本研究有助于拓宽和深化我们对eEF1A在鱼类卵子发生中的认识，进而为水产养殖鱼类获得高质量卵子提供理论依据。

卵子发生是完成生殖的先决条件，对卵子发生的调控机制研究是生物学研究热点之一。卵子发生过程高度复杂，需要众多蛋白质参与。翻译延伸因子eEF1A家族对蛋白质翻译不可或缺，42Sp50是eEF1A家族的特殊成员，它是卵巢特异的翻译延伸因子。项目负责人前期建立了尼罗罗非鱼42Sp50突变系，发现缺失42Sp50导致卵泡发育阻滞、类固醇合成降低。在此基础上，本研究从以下三个方面深入探讨42Sp50在卵子发生中的作用机制：1）分析42Sp50-/-雌鱼卵巢后期表型；2）筛选、鉴定42Sp50下游关键基因，并分析其作用机制；3）回救42Sp50-/-雌鱼卵巢表型。取得结果如下：1）组织学分析表明，在240 dah（days after hatching）时，42Sp50-/-雌鱼维持卵泡发育阻滞卵巢表型；通过IHC、Western Blot和血清雌激素水平测定证实，缺失42Sp50导致类固醇合成减少；2）通过对42Sp50-/-雌鱼卵巢转录组、卵泡蛋白质组，以及eEF1A抑制剂处理雌鱼卵泡蛋白质组进行联合分析，筛选3组数据中表达变化呈现一致的基因，发现mTOR信号通路基因mTOR、raptor、s6ka和rsp6等一致呈现下调表达；并且，Rapamycin（mTOR通路抑制剂）处理雌鱼与42Sp50-/-雌鱼同样表现出卵泡发育阻滞、无法形成由成熟颗粒细胞和鞘膜细胞组成的成熟滤泡层的卵巢表型；另一方面，MHY1485处理（mTOR通路激动剂）处理可回救缺失42Sp50-/-雌鱼卵巢表型，卵巢中可观察到成熟卵泡。这些结果表明mTOR信号通路可能是42Sp50的关键下游作用因子；3）通过雌激素处理，无法回救缺失42Sp50导致的卵巢表型，表明类固醇降低不是导致卵泡发育阻滞的主要原因；通过转基因过表达42Sp50，成功回救42Sp50-/-雌鱼卵泡发生阻滞和类固醇合成异常的卵巢表型。本研究主要发现，mTOR信号通路可能是42Sp50的关键下游作用基因；缺失42Sp50导致mTOR信号通路相关基因的蛋白质合成受阻，造成mTOR信号通路功能紊乱，继而导致卵泡发育阻滞，且无法形成成熟滤泡层；同时，42Sp50-/-雌鱼类固醇合成紊乱，是由于无法形成成熟滤泡层，类固醇生成细胞减少所致。本研究有助于拓宽和深化我们对eEF1A在鱼类卵子发生中的认识，还可为罗非鱼生殖控制提供理论基础。